牛分枝桿菌MPB64基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種人獸共患傳染病。人畜結(jié)核病的交叉?zhèn)鞑ナ窃斐山Y(jié)核病廣泛流行的重要原因之一。由于牛與人類(lèi)關(guān)系密切，致使人類(lèi)結(jié)核病的10％以上是由牛分枝桿菌引起的，所以，牛結(jié)核的存在嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。本病的傳播流行直接影響著畜牧業(yè)的發(fā)展，而且還會(huì)通過(guò)各種途徑傳染給人。因此，采取一切措施防治結(jié)核病已是勢(shì)在必行。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，人結(jié)核病呈世界范圍性的回升，每年死亡人數(shù)達(dá)300萬(wàn)，屬各類(lèi)傳染病死亡人數(shù)之首，創(chuàng)近年來(lái)歷史

2、最高記錄。專(zhuān)家們估計(jì)，至2005年，結(jié)核病死亡人數(shù)將超過(guò)500萬(wàn)。我國(guó)現(xiàn)有結(jié)核病人600萬(wàn)，是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的國(guó)家之一，加之人口的流動(dòng)，結(jié)核多重耐藥菌株(MDR)的出現(xiàn)，與艾滋病的合并感染，以及多種社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素造成了診斷和治療上的巨大困難，嚴(yán)重影響到結(jié)核病的控制。因此，結(jié)核病成為人們關(guān)注的公共健康問(wèn)題。為了紀(jì)念Kock1882年3月24日發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌，世界衛(wèi)生組織決定從1996年起將每年的3月24日定為結(jié)核病防制日，以警鐘長(zhǎng)鳴

3、。WHO指出：“在存在牛結(jié)核的國(guó)家中，人類(lèi)始終受到它的威脅，除非著手消滅牛結(jié)核病，否則，人類(lèi)結(jié)核病的控制是不會(huì)成功的”。目前，一些較發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)，如美國(guó)、澳大利亞、北歐等已基本消滅了牛結(jié)核病，但由于人結(jié)核病和野生動(dòng)物結(jié)核病的存在，致使這些國(guó)家仍對(duì)牛結(jié)核處于不斷的檢疫和高度的警惕之中。在廣大的發(fā)展中國(guó)家，該病仍嚴(yán)重的流行。但是，近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，對(duì)牛分枝桿菌的基因序列及其主要功能以及發(fā)病機(jī)理和免疫機(jī)制等都有了

4、新的認(rèn)識(shí)和了解，這些均將有利于結(jié)核病的防治。 結(jié)核桿菌主要是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，在抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌的免疫中，細(xì)胞介導(dǎo)免疫起主要作用。研究證實(shí)，起主要免疫保護(hù)作用的蛋白是活菌的分泌蛋白，是這些蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫保護(hù)作用。在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在大量能被CD4+和CD8+T細(xì)胞所識(shí)別的蛋白抗原，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有保護(hù)作用。存在于早期培養(yǎng)濾液的保護(hù)性抗原有Ag85B，MPB64，ESAT-6等，它們可介導(dǎo)細(xì)菌與機(jī)體免疫系統(tǒng)之間的

5、作用，尤其在感染早期起重要作用。經(jīng)研究有關(guān)結(jié)核病的特異性免疫，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素均直接與幾種分泌蛋白有關(guān)。MPB64是牛分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的一種蛋白質(zhì)，是牛分枝桿菌的主要保護(hù)性抗原，且為菌體表面的運(yùn)輸脂蛋白，可能是感染早期抗體識(shí)別的主要目標(biāo)蛋白。編碼MPB64的質(zhì)粒DNA能誘導(dǎo)接種小鼠、豚鼠及牛產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，IgG1和IgG2混合抗體及抗牛分枝桿菌的保護(hù)力。 本實(shí)驗(yàn)旨在國(guó)內(nèi)外人結(jié)核研究的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)

6、技術(shù)以測(cè)定牛分枝桿菌的MPB64基因序列及其在大腸桿菌中的表達(dá)為主要研究?jī)?nèi)容，目的在于研究牛分枝桿菌的分子生物學(xué)特性，為研制有效的核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。在本研究中，以牛分枝桿菌ValleeⅢ的染色體DNA為摸板，PCR擴(kuò)增MPB64成熟蛋白基因，選用pGEM-Tvectorsystem成功克隆了牛分枝桿菌MPB64成熟蛋白基因。通過(guò)酶切鑒定和PCR鑒定，證實(shí)了所克隆的基因與目的基因大小一致。通過(guò)序列測(cè)定及DNASTAR分析發(fā)現(xiàn)，所克隆的MP

7、B64成熟蛋白基因序列與MycobacteriumbovisBCGTokyo株的MPB64成熟蛋白基因序列同源性為100％，氨基酸序列也完全一致，表明該基因在牛分枝桿菌中是高度保守的。進(jìn)一步將克隆至pGEM-T中的MPB64成熟蛋白基因亞克隆至pET28a(+)表達(dá)系統(tǒng)中，構(gòu)建了高效原核表達(dá)質(zhì)粒，該表達(dá)質(zhì)粒在與之相匹配的E.coliBL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h后，表達(dá)量達(dá)到了高峰。薄層掃描結(jié)果顯示表達(dá)量達(dá)28％。經(jīng)免疫印跡分析