牛分枝桿菌MPB64基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫研究.pdf

1、牛結(jié)核病(Bovinetuberculosis)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種人獸共患傳染病，該病的流行與傳播不僅嚴(yán)重地影響著畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，而且也嚴(yán)重地威脅和危害著人類的生命與健康，被國際獸疫局(OIE)列為B類傳染病。人結(jié)核病的10﹪以上是由牛分枝桿菌引起的。近年來，人結(jié)核病在世界范圍內(nèi)大幅回升，每年死亡人數(shù)高達(dá)300萬，是其它傳染病死亡人數(shù)之和，當(dāng)屬傳染病之魁首。由于牛結(jié)核病的存在，致使人結(jié)

2、核病最終無法根除。 結(jié)核分枝桿菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染主要依靠細(xì)胞免疫。DNA疫苗能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白抗原通過MHCⅠ類分子呈遞抗原，激活CTL及殺滅靶細(xì)胞是DNA疫苗發(fā)揮保護(hù)作用的最主要機(jī)制之一，這正是抗結(jié)核感染所必需的。為了研制牛結(jié)核病敏感、特異的診斷試劑和新型、高效的預(yù)防制劑，尤其是DNA疫苗，本研究進(jìn)行了以下幾方面的工作： 1、主要

3、保護(hù)性抗原MPB64基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆質(zhì)粒pGEM-T-64中的MPB64基因亞克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中，成功地構(gòu)建出真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-64。 2、真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-64在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，通過熒光抗體技術(shù)和RT-PCR技術(shù)證實(shí)MPB64基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。 3、真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-64的免疫研究為研究真核

4、重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫特性，以pVAX1-64分別對BALB/c小鼠和豚鼠進(jìn)行了免疫，同時(shí)設(shè)pVAX1、生理鹽水和BCG對照組。間接ELISA檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對MPB64抗原的特異性抗體，抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而升高，但仍不及BCG對照組。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明，pVAX1-64免疫組產(chǎn)生了相當(dāng)于BCG水平的細(xì)胞免疫。 上述研究結(jié)果表明，本研究構(gòu)建了M.bovis主要保護(hù)性抗原MPB64基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，該