分枝桿菌同源膜錨定表達(dá)載體的構(gòu)建與細(xì)胞定位分析.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis)的病原菌,而卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)是全球公認(rèn)的唯一有效的結(jié)核疫苗。通過表達(dá)某些重要保護(hù)性抗原編碼基因來構(gòu)建重組卡介苗(recombinantbacillus Calmette-Guérin,rBCG)是改進(jìn)結(jié)核疫苗效力的重要方法之一。通常情況下,構(gòu)建的rBCG將抗原分泌至胞外或錨定于細(xì)胞

2、外膜表面,可更為有效地遞呈并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
　　 目的：比較結(jié)核分枝桿菌(M.tb)突變型啟動子pfurAma的突變體pfurAma-N和pfurAma-N3以及phsp60控制基因表達(dá)的活性,用以構(gòu)建分枝桿菌膜錨定表達(dá)載體,并分析外源目的蛋白的表達(dá)情況及其亞細(xì)胞定位分析。
　　 方法：PCR擴(kuò)增啟動子pfurAma突變體,并在其5’端額外引入Nde I酶切位點以便于信號序列或標(biāo)簽分子的克隆,并將導(dǎo)致的pfurAma-N

3、(pfurAma啟動子起始密碼子上游-3～-1位AGT→CAT突變)和pfurAma-N3(pfurAma啟動子起始密碼子上游-1位增加三個密碼子CAT)分別亞克隆入探針載體pMC210,以pfurAma和phsp60啟動子重組報告質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155,通過檢測胞外β-半乳糖苷酶活性評估啟動子活性。然后選取最強的啟動子pfurAma-N取代pMV261載體中的phsp60啟動子,從而構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)載體pMFA42。隨后,

4、人工合成帶有Nde I和BamH I粘性末端的結(jié)核分枝桿菌19 kDa抗原膜結(jié)合信號序列的正義鏈和反義鏈,退火后將其直接亞克隆至pMFA42載體中構(gòu)建膜錨定表達(dá)載體pMFA42M。PCR擴(kuò)增增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因,分別亞克隆至上述兩種不同類型的載體中并電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌(M.s),分別獲得重組EGFP融合胞內(nèi)表達(dá)菌株和膜錨定表達(dá)菌株:接著,將M.tb主要保護(hù)性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的編碼基因亞克隆入膜錨

5、定表達(dá)載體pMFA42M中構(gòu)建M.tb抗原-EGFP融合表達(dá)菌株；通過Western-blot和流式細(xì)胞表面標(biāo)記技術(shù)來分析目的抗原的表達(dá)水平及其亞細(xì)胞定位,并進(jìn)一步通過熒光顯微鏡直接觀察重組EGFP融合表達(dá)菌株在體外和感染巨噬細(xì)胞后的熒光強度。
　　 結(jié)果：成功擴(kuò)增出啟動子突變體pfurAma-N和pfurAma-N3,啟動子活性分析發(fā)現(xiàn)pfurAma啟動子起始密碼子上游三位密碼子的突變并不影響啟動子活性,pfurAma-N與p

6、furAma活性相當(dāng),均為phsp60活性的2倍左右;而增加啟動子和起始密碼間的距離則將導(dǎo)致其活性顯著下降,pfurAma-N3活性僅為phsp60的一半。通過引入M.tb19 kDa脂蛋白膜分泌信號,在高效的啟動子pfurAma-N的驅(qū)動下,成功地構(gòu)建了分枝桿菌膜錨定表達(dá)載體。利用EGFP作為標(biāo)簽抗原,通過Western—blot、熒光顯微觀察和流式細(xì)胞表面標(biāo)記等技術(shù)均證實了外源目的抗原可在分枝桿菌中高水平表達(dá)并定位至細(xì)胞膜上。