結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染病,MTB可能侵入人體全身各種器官,但主要侵犯肺,稱為肺結(jié)核。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全世界每年有1000萬新發(fā)病例,150萬人死于結(jié)核病。我國高居全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家的第二位,現(xiàn)有MTB感染人數(shù)已達(dá)4億,傳染性TB患者達(dá)到200萬?？ń槊?BCG)作為目前唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗,對(duì)于兒童重癥結(jié)

2、核病如粟粒型結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎具有預(yù)防作用,但是對(duì)于預(yù)防成年人結(jié)核病效果不理想,保護(hù)率為0-80％不等。目前,很多國家都在研究結(jié)核新疫苗,已有200多種的候選疫苗,其中有的正在進(jìn)行動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn),有的已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。近幾十年,隨著耐藥MTB增多及HIV共感染等問題,加重了結(jié)核病的嚴(yán)重性。所以開發(fā)新型有效的結(jié)核病疫苗迫在眉睫,希望盡快開發(fā)出更安全、高效、低成本、并可廣泛用于各類人群的新型結(jié)核病疫苗。
　　 本文以廣泛使用的Ad-E

3、asy腺病毒包裝系統(tǒng)為基礎(chǔ),構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒疫苗。首先PCR獲取結(jié)核分枝桿菌MPT83基因,然后再將MPT83基因重組于穿梭載體pAdTrack-CMV；通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將線性化的重組穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV-MPT83)和病毒骨架質(zhì)粒(pAdEasy-1)共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BJ5183,重組穿梭質(zhì)粒和病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183發(fā)生同源重組形成重組腺病毒質(zhì)粒(rAd-GFP-MPT83)；線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、染HEK293細(xì)胞,并于HEK293細(xì)胞中包裝成病毒；mRNA和蛋白水平上檢測目的基因的表達(dá):大量擴(kuò)增腺病毒,體外通過MTT實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證重組腺病毒的免疫原性:體內(nèi)通過重組腺病毒免疫小鼠,整體熒光成像觀察報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)在小鼠體內(nèi)的表達(dá)與分布,間接跟蹤目的基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果表明:
　　 (1)成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體,構(gòu)建的重組腺病毒載體于HEK293細(xì)胞中成功包裝腺病毒。通過RT-P

5、CR和Western-Blotting實(shí)驗(yàn),分別于mRNA和蛋白水平上檢測均表明結(jié)核分枝桿菌MPT83基因在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。
　　 (2)MTT實(shí)驗(yàn)表明:vAd-GFP-MPT83病毒液比vAd-GFP病毒液具有更強(qiáng)的刺激體外淋巴細(xì)胞增殖的能力,證實(shí)了目的蛋白具有很強(qiáng)的刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力,即其免疫原性。
　　 (3)小鼠活體實(shí)驗(yàn)表明:vAd-GFP-MPT83病毒免疫小鼠后,報(bào)告基因GFP于免疫后第4d達(dá)到高