GLS-IL-12重組恥垢分枝桿菌對(duì)小鼠結(jié)核病的治療作用.pdf

1、國(guó)內(nèi)外研究背景： 1．結(jié)核病位居單一病原體引起病人死亡的嚴(yán)重傳染病之首。耐多藥菌株的流行、合并HIV感染、化療時(shí)間較長(zhǎng)等是目前阻礙結(jié)核病防治工作的幾大障礙。 2．傳統(tǒng)疫苗主要用于疾病的預(yù)防，而近幾年發(fā)展較快的治療性疫苗可通過(guò)加強(qiáng)或調(diào)整患者的免疫功能達(dá)到治療目的，特別是對(duì)一些慢性感染性疾病的治療。目前結(jié)核病治療性疫苗的研究主要集中在DNA疫苗、滅活分枝桿菌疫苗和活疫苗等幾個(gè)方面。 3．結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，

2、巨噬細(xì)胞首先發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌作用。Th1型免疫應(yīng)答在抗結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中有重要的保護(hù)作用。IL-12是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，主要誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。 4．GLS是人NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞產(chǎn)生的一種天然抗菌肽，具有抗多種微生物和腫瘤的活性。血清GLS水平和宿主的細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)。GLS可直接殺滅細(xì)胞外的Mtb，通過(guò)改變細(xì)胞膜的完整性，在穿孔素輔助下可進(jìn)入巨噬細(xì)胞中對(duì)胞內(nèi)吞噬的Mtb進(jìn)行殺傷。 研究目的：

3、 構(gòu)建可靶向遞送pZM03進(jìn)入肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗，并從體外細(xì)胞水平、活體水平探討其誘導(dǎo)GLS和IL-12 的表達(dá)，激發(fā)小鼠抗結(jié)核特異性免疫反應(yīng)的能力；觀察該重組活疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠的治療作用，并用抗癆藥物及免疫調(diào)節(jié)劑．微卡等評(píng)估其治療效果。 研究方法： 1．通過(guò)分步克隆，分別將GLS基因片段亞克隆入雙啟動(dòng)子真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1的HindⅢ/B

4、amHI位點(diǎn)中、鼠單鏈IL-12基因亞克隆入NotI/KpnI位點(diǎn)中、分枝桿菌復(fù)制子OriM基因亞克隆入NheI位點(diǎn)中，形成穿梭/共表達(dá)質(zhì)粒pZM03并導(dǎo)入巨噬細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)RT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)目標(biāo)基因產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 2．將pZM03質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株．ATCC607，制備GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌，PCR進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增；洗滌后導(dǎo)入RAW2

5、64.7細(xì)胞后作RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 3．以pZM03，BCG，ATCC607，重組恥垢分枝桿菌，滅活重組恥垢分枝桿菌，生理鹽水6組滴鼻免疫BALB/c小鼠3次，4周后觀察肺脾病理改變；作抗酸染色了解重組菌的分布；免疫組織化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)GLS、IL-12在組織中的表達(dá)；特異性PPD抗原刺激后脾淋巴細(xì)胞增殖情況；支氣管灌洗液SIgA、血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IgG2a含量

6、測(cè)定。 4．刮取改良羅琴氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)4周的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，加0.05％Tween80生理鹽水磨菌制成懸液，用菌落計(jì)數(shù)后以每只小鼠5X10<'4>CFU/50μl滴鼻感染，制作結(jié)核分枝桿菌感染模型。 5．結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后，分別用生理鹽水、恥垢分枝桿菌、pZM03、重組恥垢分枝桿菌治療6次，于第一次治療后3個(gè)月，處死小鼠，檢測(cè)器官荷菌量、脾淋巴細(xì)胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平

7、、血清IL-12和IFN-γ、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾組織中GLS表達(dá)，同時(shí)觀察小鼠肺、脾組織病理改變情況。 6．結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后，分別用生理鹽水、重組恥垢分枝桿菌、抗癆藥(INH+PZA)、重組恥垢分枝桿菌+INH+PZA、微卡+INH+PZA等治療3個(gè)月后，通過(guò)觀察小鼠肺、脾病理改變及體內(nèi)免疫狀態(tài)的調(diào)整等評(píng)估重組疫苗的治療效果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．成功構(gòu)建了攜帶GLS、小

8、鼠單鏈IL-12、分枝桿菌復(fù)制子OriM的穿梭/共表達(dá)質(zhì)粒pZM03，導(dǎo)入巨噬細(xì)胞后通過(guò)RT-PCR、EIASA、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都檢測(cè)到了目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物。 2．成功得到了靶向性良好的GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌，導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞后RT-PCR檢測(cè)到了GLS和IL-12的表達(dá)。 3．以重組恥垢分枝桿菌滴鼻免疫BALB/c小鼠，4周后肺脾組織無(wú)明顯病理改變，免疫組化檢測(cè)到GLS的表達(dá)，血

9、清IFN-γ、IL-12和IgG2a含量、PPD刺激后脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量較其它對(duì)照組明顯增高。 4．結(jié)核分枝桿菌H37Rv 5X10<'4>CFU/50μl滴鼻感染小鼠4周后，所有小鼠肺、脾組織中均可見(jiàn)抗酸陽(yáng)性菌，肺、脾組織可檢測(cè)出細(xì)菌，肺組織病理改變明顯，正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，以充血實(shí)變、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主，增生性改變不明顯，未見(jiàn)明顯的組織壞死。脾組織病理改變主要是巨噬細(xì)胞增生。 5．重組恥垢分枝桿菌

10、滴鼻治療12周后，肺組織病變范圍和程度與其它組比較明顯好轉(zhuǎn)；肺和脾的器官荷菌量也降低；小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-μ和TNF-α、血清中IL-12和IFN-γ的分泌水平及支氣管肺泡灌洗液PPD特異SIgA都明顯高于其它組；免疫組化法檢測(cè)到小鼠肺和脾組織中GLS的表達(dá)。 6．用INH+PZA、重組恥垢分枝桿菌聯(lián)合INH+PZA及微卡聯(lián)合INH+PZA同時(shí)治療12周后，結(jié)果顯示：?jiǎn)为?dú)使用重組恥垢分枝桿菌在病理改變、荷菌量降低方面的效果不如

11、INH+PZA，但Th1免疫應(yīng)答好于INH+PZA；重組恥垢分枝桿菌聯(lián)合INH+PZA治療效果優(yōu)于單獨(dú)INH+PZA和微卡聯(lián)合INH+PZA的治療效果。 結(jié)論： 1．人顆粒溶素和小鼠IL-12能在小鼠巨噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)共表達(dá)； 2．利用恥垢分枝桿菌作為生物體載體廉價(jià)、大量克隆并靶向遞送外源治療性基因進(jìn)入巨噬細(xì)胞中表達(dá)是可能的； 3．體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都表明，GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌疫苗具有良好的靶向性，并能