屋塵螨抗原Der p2重組恥垢分枝桿菌口服疫苗的制備及其實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、支氣管哮喘（Asthma）是嚴(yán)重威脅人類健康的一種常見慢性疾病，其發(fā)病率和死亡率在世界各地呈逐年上升的趨勢，糖皮質(zhì)激素雖能有效地控制其癥狀，但因其長期使用會出現(xiàn)不良反應(yīng)，以及不能糾正機(jī)體已有的免疫紊亂和阻斷疾病進(jìn)程，因此臨床上迫切需要尋找有效的途徑來預(yù)防此類變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，變態(tài)反應(yīng)性疾病患者體內(nèi)呈現(xiàn)過度的Th2型免疫應(yīng)答，而結(jié)核桿菌等分枝桿菌感染可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的Thl型免疫應(yīng)答。為改變機(jī)體對某些過敏原Th2優(yōu)

2、勢應(yīng)答的狀態(tài)，我科曾成功將屋塵螨抗原Derp2基因轉(zhuǎn)入卡介苗（BCG）中表達(dá)，制備出抗原重組BCG(rBCG)。經(jīng)靜脈和腹腔注射接種后，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了Derp2特異性的Th1優(yōu)勢應(yīng)答。這意味著象哮喘這類對某些特定抗原過敏的疾病，可以利用抗原rBCG作為疫苗而得到治療。
　　但是短期內(nèi)重復(fù)注射接種rBCG會引起局部嚴(yán)重的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)而影響療效。為此，進(jìn)一步給小鼠口服Derp2-rBCG，結(jié)果同樣誘導(dǎo)了抗原特異性的Th1應(yīng)答。相關(guān)

3、研究表明，口服分枝桿菌疫苗不僅能夠刺激理想的免疫應(yīng)答，而且經(jīng)濟(jì)方便。然而，分枝桿菌不是腸道定植菌，其與腸道粘膜的親和力過低，大量口服還會引起腸道正常菌群失調(diào)和口咽部感染，從而影響免疫效果。研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲菌（C.jejuni）外膜蛋白PEB1是C.jejuni的主要粘附分子，在C.jejuni與腸道粘膜的粘附中發(fā)揮重要作用，這為制備抗原特異性的腸道高親和力重組分枝桿菌口服疫苗創(chuàng)造了條件。
　　目的：
　　1.利用基因工程手

4、段，構(gòu)建能以胞壁形式表達(dá)屋塵螨Derp2和C.jejuniPEB1抗原的重組恥垢分枝桿菌(rM.S)口服疫苗Derp2-PEB1-rM.S。
　　2.將Derp2-PEB1-rM.S與Derp2-rM.S一起口服免疫小鼠，比較兩者的生物學(xué)行為及免疫學(xué)特性，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　1.PEB1蛋白的表達(dá)及純化
　　以C.jejuniPennerO:19標(biāo)準(zhǔn)株基因組為模板，用PCR法擴(kuò)增P

5、EB1基因，并與pUC19克隆載體連接，經(jīng)測序證實(shí)與Genbank公布的C.jejuniPEB1基因序列完全一致。將PEB1基因克隆入pPROEXHTb原核表達(dá)載體，酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pPRO-PEB1，并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明成功地表達(dá)了與預(yù)期分子量一致的PEB1融合蛋白；Western-blot證實(shí)該蛋白可與抗His-mAb發(fā)生特異性反應(yīng)。可溶性分析顯示該蛋白以可溶形式存在于上清中，用Ni-NTA親和色譜

6、法純化獲得了目的蛋白，純度達(dá)90％以上。
　　2.小鼠抗PEB1蛋白多克隆抗體的制備
　　用皮下包埋的方法，以預(yù)先轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的純化PEB1蛋白免疫BALB/c小鼠，共免疫三次，每次間隔2周，最后一次免疫結(jié)束2周后收集小鼠血清，同時設(shè)生理鹽水對照。間接ELISA方法測定免疫小鼠血清中PEB1蛋白特異性抗體滴度為1：204800。
　　3.胞壁表達(dá)Derp2-PEB1融合蛋白重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建和鑒定
　

7、　用PCR法分別擴(kuò)增PEB1和Derp2基因，經(jīng)測序正確后按照相應(yīng)的酶切位點(diǎn)將兩者克隆入pUC19，得到Derp2-PEB1融合基因。將Derp2-PEB1融合基因亞克隆入大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭胞壁表達(dá)載體pCW，構(gòu)建可胞壁表達(dá)Derp2-PEB1融合蛋白的重組質(zhì)粒pCW-Derp2-PEB1，并經(jīng)酶切鑒定證實(shí)。將重組質(zhì)粒電穿導(dǎo)入M.S感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)潮霉素抗性篩選rM.S陽性克隆。陽性rM.S經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增目的基因片段，證實(shí)其中含

8、有目的基因。用抗Derp2單克隆抗體和制備的小鼠PEB1抗血清對rM.S進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，證實(shí)Derp2-PEB1融合蛋白可以在M.S表面表達(dá)。
　　4.消化道環(huán)境對重組M.S疫苗生物學(xué)行為的影響
　　分別以100μlpCW-Derp2-PEB1-rM.S、pCW-Derp2-rM.S和M.S（1×1013CFU·L－1）灌胃免疫BALB/c小鼠，連續(xù)5天。于首次免疫后第1、6、8、10、14、28、56d收集各組小鼠糞

9、便，處理后涂布于7H10瓊脂平板，培養(yǎng)后計數(shù)平板上M.S的CFU。分別于末次免疫后第2、14、28、56d處死小鼠，無菌分離腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）、脾臟和肺臟，勻漿后涂布7H10瓊脂平板，計數(shù)平板上M.S的CFU。結(jié)果顯示，各組小鼠于口服免疫后次日即可在其糞便中排出M.S，第6天最多，隨后逐漸減少，至免疫后2周完全消失，各組之間并無差異。小鼠口服免疫結(jié)束后第2、14、28天均能在GALT勻漿中檢出M.S，其中pCW-Derp2-P

10、EB1-rM.S組各時間點(diǎn)菌落數(shù)均較pCW-Derp2-rM.S組明顯增加（P＜0.05）。除第56天外，各組小鼠在其余各時間點(diǎn)均能在肺中檢出少量M.S。而所有小鼠在各個時間點(diǎn)均未從脾臟中檢出M.S。上述結(jié)果表明，PCW-Derp2-PEB1-rM.S更易于被腸道粘膜攝取并進(jìn)入GALT。
　　5.不同親和力rM.S口服接種刺激BALB/c小鼠免疫應(yīng)答的差異
　　分別予以100μlpCW-Derp2-PEB1-rM.S、pCW

11、-Derp2-rM.S、M.S（1×1013CFU·L－1）和甘油灌胃免疫BALB/c小鼠，連續(xù)5天。于末次免疫后14、28、56天將小鼠摘眼球取血，收集血清，并制備脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，用夾心ELISA法分別測定其中IFN-γ、IL-2和IL-4水平。結(jié)果表明，兩種疫苗免疫后小鼠血清和脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2水平均明顯升高，Th2型細(xì)胞因子IL-4水平則明顯下降；在小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入Derp2刺

12、激可使IFN-γ、IL-2含量升高、IL-4含量降低較M.S組更為明顯；兩種rM.S之間的比較也發(fā)現(xiàn)，pCW-Derp2-PEB1-rM.S組較pCW-Derp2-rM.S組IFN-γ、IL-2水平有明顯升高，而IL-4水平無明顯差異。這說明：rM.S免疫后在小鼠體內(nèi)引發(fā)的免疫反應(yīng)以誘導(dǎo)Th1優(yōu)勢為主，且這種應(yīng)答是Derp2特異性的；PEB1導(dǎo)入rM.S后可以提高rM.S口服的免疫效率。
　　結(jié)論：
　　1.兩種不同親和力的