豬囊尾蚴抗原cC1的高效表達(dá)及其重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建.pdf

1、目的：(1)高效可溶性原核表達(dá)并純化豬囊尾蚴抗原cC1；?(2)構(gòu)建表達(dá)抗原cC1的重組恥垢分枝桿菌疫苗。
　　方法：(1)將重組質(zhì)粒pET28a-cC1轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)中，挑取單個菌落，培養(yǎng)擴(kuò)增至OD600約為0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG，同時設(shè)空載體質(zhì)粒及未誘導(dǎo)的菌株為對照，以SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。對誘導(dǎo)時間和IPTG濃度進(jìn)行分析，優(yōu)化表達(dá)條件。在優(yōu)化的條件下，大量培養(yǎng)含pET28a-c

2、C1的菌株，IPTG誘導(dǎo)后超聲波破菌，分離上清和沉淀，上清經(jīng)His親和層析柱純化，再通過AKTA explorer100型快速液相蛋白層析分離系統(tǒng)進(jìn)一步純化并檢測其純度，采用SDS-PAGE電泳和Wester-blotting對目的蛋白進(jìn)行分析和驗(yàn)證。(2)提取pET28a-cC1質(zhì)粒DNA用XhoI和BamHI雙酶切，用Kelow酶補(bǔ)平XhoI酶切末端，同時提取pMV261穿梭質(zhì)粒載體，用HindIII和BamHI雙酶切，用Kelow

3、酶補(bǔ)平HindIII酶切末端，純化后的酶切產(chǎn)物以T4連接酶連接，構(gòu)建pMV261-cC1穿梭質(zhì)粒，測序驗(yàn)證正確后，將 pMV261-cC1穿梭質(zhì)粒經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌，構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌疫苗，挑取陽性菌落，培養(yǎng)擴(kuò)增經(jīng)熱誘導(dǎo)后以 SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)，并以抗cC1小鼠血清對表達(dá)蛋白進(jìn)行Wester-blotting鑒定。
　　結(jié)果：(1)采用不同濃度的誘導(dǎo)劑和不同的誘導(dǎo)時間對 pET28a-cC1的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)

4、行優(yōu)化，通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果為0.05 mmol/LIPTG誘導(dǎo)6 h時可達(dá)最大的表達(dá)量，再加大誘導(dǎo)劑濃度和延長誘導(dǎo)時間，蛋白表達(dá)量不僅未見增加，反而呈下降趨勢；超聲破菌后分別 SDS-PAGE電泳分析取上清和沉淀，結(jié)果表明重組蛋白在37℃時大量表達(dá)，且主要為可溶性表達(dá)；表達(dá)量高達(dá)菌體總蛋白的60％；優(yōu)化條件下大量表達(dá)，經(jīng)His柱純化，AKTA explorer100型快速液相蛋白層析分離系統(tǒng)檢測其純度，蛋白純度達(dá)

5、到94%。表達(dá)的分子量約為40 kD的可溶性融合蛋白能被囊蟲病患者血清識別。(2)構(gòu)建的重組穿梭載體經(jīng)酶切、測序驗(yàn)
　　證正確；構(gòu)建的重組恥垢分枝桿菌疫苗熱誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析和western-bloting驗(yàn)證，在40 kD處有蛋白表達(dá)，與預(yù)期值相符，表明cC1抗原基因在恥垢分枝桿菌中表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功優(yōu)化了cC1蛋白高效可溶性原核表達(dá)條件，獲得了純度達(dá)94%且具備抗原性的cC1蛋白。