LRG47-EBP50基因共修飾的恥垢分枝桿菌治療性靶向載體疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　 構(gòu)建LRG47/EBP50和LRG47/EBP50-RFP基因共修飾的恥垢分枝桿菌治療性載體疫苗,使之能靶向進(jìn)入Mφ,以便于后續(xù)從分子和細(xì)胞水平研究其抗Mtb感染的效果和機(jī)制。有望克服潛伏感染、多重耐藥和再燃等結(jié)核病治療難題,為開辟一條結(jié)核病防治的新思路奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究策略與方法:
　　 1.利用RT-PCR從小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中擴(kuò)增出EBP50基因、LRG47基因分別

2、克隆至pCDNA3.1中,送去測序。測序正確后,通過次序嚴(yán)密的分步克隆,將EBP50基因片段亞克隆入雙啟動(dòng)子真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHⅠ位點(diǎn)中、將LRG47基因亞克隆入pBudCE4.1的KpnⅠ/XhoⅠ位點(diǎn)中、分枝桿菌復(fù)制子OriM基因亞克隆入pBudCE4.1的NheⅠ位點(diǎn)中,形成穿梭/共表達(dá)質(zhì)粒pLEM并轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)鑒定。通過RT-PCR和Westernblot對(duì)目標(biāo)基因產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

3、
　　 2.利用PCR從pSIREN-DNA-DsRed-Express中擴(kuò)增出RFP基因并克隆至pCDNA3.1的EcoRⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)中,形成pCDNA3.1-RFP,利用PCR從pLEM中擴(kuò)增出EBP50基因并克隆至pCDNA3.1的HindⅢ/EcoRⅠ位點(diǎn),形成pCDNA3.1-EBP50②,測序正確后,將EBP50基因亞克隆至pCDNA3.1-RFP中。通過次序嚴(yán)密的分步克隆,將EBP50-RFP片段亞克隆入雙啟動(dòng)

4、子真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHⅠ位點(diǎn)中、將LRG47基因亞克隆入pBudCE4.1的KpnⅠ/XhoⅠ位點(diǎn)中、分枝桿菌復(fù)制子OriM基因亞克隆入pBudCE4.1的MheⅠ位點(diǎn)中,形成穿梭/共表達(dá)質(zhì)粒pERLO并轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過RT-PCR、熒光顯微鏡直接觀察和Westernblot對(duì)目標(biāo)基因產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
　　 3.通過Westernblot檢測恥垢分枝桿菌Ms1-2c對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞

5、(PDMs)內(nèi)源性表達(dá)的EBP50、LRG47的影響。將pLEM、pERLO質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌Ms1-2c,鑒定無誤后分別命名為rMS-pLEM、rMS-pERLO,擴(kuò)增、洗滌后用于感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PDMs),觀察其對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建了攜帶小鼠EBP50基因、小鼠LRG47基因、分枝桿菌復(fù)制子OriM基因的共表達(dá)質(zhì)粒pLEM,轉(zhuǎn)染入人293T

6、細(xì)胞中后通過RT—PCR、Westernblot等方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都檢測到了目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物。
　　 2.成功構(gòu)建了攜帶小鼠EBP50-RFP表達(dá)基因、小鼠LRG47基因、分枝桿菌復(fù)制子OriM基因的共表達(dá)質(zhì)粒pERLO,轉(zhuǎn)染入人293T細(xì)胞中后通過RT—PCR、熒光觀察和Westernblot方法均檢測到了目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)染入小鼠RAW264.7中觀察到紅色熒光表達(dá)。
　　 3.Ms1-2c能促進(jìn)小鼠腹腔巨

7、噬細(xì)胞內(nèi)的EBP50、LRG47內(nèi)源性表達(dá)。成功得到了靶向性良好的重組恥垢分枝桿菌rMS-pLEM、rMS-pERLO。
　　 結(jié)論:
　　 1.LRG47與EBP50能同時(shí)在真核細(xì)胞中表達(dá)出來。
　　 2.EBP50與RFP能融合表達(dá),便于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中EBP50在巨噬細(xì)胞內(nèi)的定位檢測。
　　 3.Ms1-2c能作為巨噬細(xì)胞的靶向性載體。
　　 4.Ms1-2c能上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性的EBP50