恥垢分枝桿菌MSMEG-5243及MSMEG-6086基因的克隆、過(guò)表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)屬于分枝桿菌屬，是引起結(jié)核病的病原體。其細(xì)胞壁是分枝桿菌賴(lài)以生存的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，核心結(jié)構(gòu)mAGP(Mycolic acid-Arabinogalactan-Peptidoglycan)由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三部分。聚阿拉伯半乳糖為連接肽聚糖和分枝菌酸、維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性的重要組分，并且組成聚阿拉伯半乳糖的阿拉伯糖為D型糖，而哺乳動(dòng)物不存在這種D型糖，所以聚阿拉

2、伯半乳糖可作為研發(fā)新一代抗結(jié)核藥物的理想靶標(biāo)。
　　 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatics, M.smegmatis)也屬于分枝菌屬，與結(jié)核分枝桿菌具有同源性，相似的細(xì)胞壁，且無(wú)致病性。辛毅教授在1996年于恥垢分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種內(nèi)源性的能降解聚阿拉伯半乳糖的聚阿拉伯糖的水解酶。能夠破壞細(xì)胞壁的完整性，是潛在的抗結(jié)核藥物的選擇。大連醫(yī)科大學(xué)董旭完成了對(duì)該酶的純化，并用質(zhì)譜對(duì)純化的蛋白進(jìn)行了分析，通過(guò)生

3、物信息學(xué)，找到了該酶的候選基因并進(jìn)行了初步的分析。在前面工作的基礎(chǔ)上，選擇了兩個(gè)候選基因MSMEG_5243和MSMEG_6086，通過(guò)克隆和過(guò)表達(dá)，來(lái)確定此兩候選基因是否與內(nèi)源性聚阿拉伯糖水解酶有關(guān)。
　　 本論文的目的是(1)克隆恥垢分枝桿菌基因MSMEG_5243及MSMEG_6086(2)恥垢分枝桿菌和大腸桿菌中過(guò)表達(dá)基因MSMEG_5243及MSMEG_6086(3)確定基因MSMEG_5243和MSMEG_6086的

4、表達(dá)產(chǎn)物是否具有聚阿拉伯糖水解酶活性
　　 本論文的方法及結(jié)果是：
　　 1．PCR擴(kuò)增基因MSMEG_5243和MSMEG_6086，DNA序列測(cè)定正確后構(gòu)建克隆載體pMD18-MSMEG_5243和pMD18-MSMEG_6086。
　　 2．構(gòu)建用于恥垢分枝桿菌表達(dá)的表達(dá)載體pVV2-MSMEG_5243和 pVV2-MSMEG_6086以及用于大腸桿菌表達(dá)的表達(dá)載體pET16b-MSMEG_5243和pE

5、T16b-MSMEG_6086并且分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株M.smegmatis mc2155和BL21(DE3)中。
　　 3.SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的蛋白表達(dá)，顯示MSMEG_5243和MSMEG_6086在M.smegmatis mc2155和BL21(DE3)中均過(guò)表達(dá)
　　 4.Ni-NTA-Agarose柱層析純化在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)的蛋白

6、。SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)到了純化的基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的過(guò)表達(dá)蛋白。
　　 5．鑒定目的蛋白的活性
　　 (1)HPLC檢測(cè)過(guò)表達(dá)目的基因的恥垢分枝桿菌的細(xì)胞壁阿拉伯糖變化，相比于野生型恥垢分枝桿菌的阿拉伯糖的量，過(guò)表達(dá)基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的細(xì)胞壁阿拉伯糖的量未發(fā)生明顯的變化。
　　 (2)掃描電鏡觀察過(guò)表達(dá)目的基因的恥垢分枝桿菌

7、的形態(tài)學(xué)變化，恥垢分枝桿菌一般成棒狀，相比于野生型的恥垢分枝桿菌的形態(tài)，過(guò)表達(dá)基因MSMEG_5243的菌株形態(tài)個(gè)別發(fā)生改變，而過(guò)表達(dá)基因MSMEG_6086的菌株形態(tài)沒(méi)有發(fā)生變化。
　　 (3)分光光度法檢測(cè)過(guò)表達(dá)目的基因的恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)狀況，繪制生長(zhǎng)曲線，相比于野生型的恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的菌株生長(zhǎng)速度都有所減慢。
　　 (4)酶活性測(cè)定，將大腸桿菌中表達(dá)的基因

8、MSMEG_5243及MSMEG_6086的蛋白與底物聚阿拉伯半乳糖反應(yīng)后，用bio-gelA1.5M凝膠過(guò)濾層析法和苯酚硫酸法對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有檢測(cè)到聚阿拉伯糖水解酶的活性。
　　 本論文的結(jié)論是：
　　 本論文利用分子克隆技術(shù)克隆了恥垢分枝桿菌的基因MSMEG_5243及MSMEG_6086基因，并在恥垢分枝桿菌和BL21(DE3)中過(guò)表達(dá)了兩基因。探討了過(guò)表達(dá)蛋白與聚阿拉伯糖水解酶的關(guān)系，從實(shí)驗(yàn)中未能檢測(cè)