恥垢分枝桿菌MSMEG-5243及MSMEG-6086基因的克隆、過表達與功能鑒定.pdf

1、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)屬于分枝桿菌屬，是引起結核病的病原體。其細胞壁是分枝桿菌賴以生存的結構基礎，核心結構mAGP(Mycolic acid-Arabinogalactan-Peptidoglycan)由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三部分。聚阿拉伯半乳糖為連接肽聚糖和分枝菌酸、維持細胞壁結構完整性的重要組分，并且組成聚阿拉伯半乳糖的阿拉伯糖為D型糖，而哺乳動物不存在這種D型糖，所以聚阿拉

2、伯半乳糖可作為研發(fā)新一代抗結核藥物的理想靶標。
　　 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatics, M.smegmatis)也屬于分枝菌屬，與結核分枝桿菌具有同源性，相似的細胞壁，且無致病性。辛毅教授在1996年于恥垢分枝桿菌中發(fā)現了一種內源性的能降解聚阿拉伯半乳糖的聚阿拉伯糖的水解酶。能夠破壞細胞壁的完整性，是潛在的抗結核藥物的選擇。大連醫(yī)科大學董旭完成了對該酶的純化，并用質譜對純化的蛋白進行了分析，通過生

3、物信息學，找到了該酶的候選基因并進行了初步的分析。在前面工作的基礎上，選擇了兩個候選基因MSMEG_5243和MSMEG_6086，通過克隆和過表達，來確定此兩候選基因是否與內源性聚阿拉伯糖水解酶有關。
　　 本論文的目的是(1)克隆恥垢分枝桿菌基因MSMEG_5243及MSMEG_6086(2)恥垢分枝桿菌和大腸桿菌中過表達基因MSMEG_5243及MSMEG_6086(3)確定基因MSMEG_5243和MSMEG_6086的

4、表達產物是否具有聚阿拉伯糖水解酶活性
　　 本論文的方法及結果是：
　　 1．PCR擴增基因MSMEG_5243和MSMEG_6086，DNA序列測定正確后構建克隆載體pMD18-MSMEG_5243和pMD18-MSMEG_6086。
　　 2．構建用于恥垢分枝桿菌表達的表達載體pVV2-MSMEG_5243和 pVV2-MSMEG_6086以及用于大腸桿菌表達的表達載體pET16b-MSMEG_5243和pE

5、T16b-MSMEG_6086并且分別轉化到表達菌株M.smegmatis mc2155和BL21(DE3)中。
　　 3.SDS-PAGE和Western blotting檢測基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的蛋白表達，顯示MSMEG_5243和MSMEG_6086在M.smegmatis mc2155和BL21(DE3)中均過表達
　　 4.Ni-NTA-Agarose柱層析純化在大腸桿菌中過表達的蛋白

6、。SDS-PAGE和Western blotting檢測到了純化的基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的過表達蛋白。
　　 5．鑒定目的蛋白的活性
　　 (1)HPLC檢測過表達目的基因的恥垢分枝桿菌的細胞壁阿拉伯糖變化，相比于野生型恥垢分枝桿菌的阿拉伯糖的量，過表達基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的細胞壁阿拉伯糖的量未發(fā)生明顯的變化。
　　 (2)掃描電鏡觀察過表達目的基因的恥垢分枝桿菌

7、的形態(tài)學變化，恥垢分枝桿菌一般成棒狀，相比于野生型的恥垢分枝桿菌的形態(tài)，過表達基因MSMEG_5243的菌株形態(tài)個別發(fā)生改變，而過表達基因MSMEG_6086的菌株形態(tài)沒有發(fā)生變化。
　　 (3)分光光度法檢測過表達目的基因的恥垢分枝桿菌的生長狀況，繪制生長曲線，相比于野生型的恥垢分枝桿菌的生長，過表達基因MSMEG_5243及MSMEG_6086的菌株生長速度都有所減慢。
　　 (4)酶活性測定，將大腸桿菌中表達的基因

8、MSMEG_5243及MSMEG_6086的蛋白與底物聚阿拉伯半乳糖反應后，用bio-gelA1.5M凝膠過濾層析法和苯酚硫酸法對反應后的產物進行檢測，沒有檢測到聚阿拉伯糖水解酶的活性。
　　 本論文的結論是：
　　 本論文利用分子克隆技術克隆了恥垢分枝桿菌的基因MSMEG_5243及MSMEG_6086基因，并在恥垢分枝桿菌和BL21(DE3)中過表達了兩基因。探討了過表達蛋白與聚阿拉伯糖水解酶的關系，從實驗中未能檢測