結(jié)核分枝桿菌NrdH-redoxin基因的克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病。全球近1/3的人口感染過(guò)結(jié)核菌。人們對(duì)結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的生物特性進(jìn)行廣泛研究，繼而研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物，使得人類(lèi)對(duì)結(jié)核病的控制取得了可喜的成績(jī)，遏制了結(jié)核病的蔓延和傳播。然而由于化學(xué)藥物的不合理應(yīng)用、艾滋病與結(jié)核病聯(lián)合感染、人口流動(dòng)的增加以及耐藥結(jié)核病菌的流行，使得近年來(lái)結(jié)核病疫情下降緩慢，在部分地區(qū)甚至有所回

2、升。當(dāng)前，在結(jié)核病控制工作中急需開(kāi)發(fā)出有效的預(yù)防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)前最為關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)致病菌，主要存在于單核吞噬細(xì)胞內(nèi)。單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS(reactive oxygen species)具有強(qiáng)的抗菌活性。因此，當(dāng)單核吞噬細(xì)胞出于防御病菌產(chǎn)生活性基團(tuán)時(shí)，結(jié)核分枝桿菌能夠發(fā)動(dòng)一個(gè)抗氧化的防御系統(tǒng)來(lái)清除氧化活性基團(tuán)，以適應(yīng)宿主巨噬細(xì)胞高度氧

3、化型的環(huán)境，并在其中持留和繁殖。結(jié)核分枝桿菌具有一系列的氧化還原蛋白來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)最適的氧化還原內(nèi)環(huán)境，從而抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化、DNA交聯(lián)和抵抗巨噬細(xì)胞的氧化攻擊等。目前的研究表明這些蛋白包括硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)、過(guò)氧化物還原酶(peroxiredoxin,Prx)、烷基過(guò)氧化氫還原酶(alkyl hydroperoxide reductase，Ahp)等。此外，結(jié)核分枝桿菌中還存在著另一種含有CXXC活性位點(diǎn)基序的

4、蛋白——NrdH-redoxin，該蛋白屬于硫氧還蛋白超家族，目前關(guān)于該蛋白的研究較少，其在細(xì)胞內(nèi)的生理功能仍有待揭示。因此，開(kāi)展對(duì)該蛋白的功能和性質(zhì)的研究，有助于進(jìn)一步了解結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)的調(diào)控及其應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的防御機(jī)制。
　　 本研究主要是對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NrdH-redoxin基因nrdH(Rv3053c)的克隆、表達(dá)及活性研究，并通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預(yù)測(cè)。從GenBa

5、nk數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NrdH-redoxin基因nrdH的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板，體外擴(kuò)增獲得nrdH基因。通過(guò)TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector，然后亞克隆至載體pET28a(+)中，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測(cè)定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-nrdH。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，

6、以溫度、時(shí)間和IPTG濃度建立三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)該重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。使用最佳表達(dá)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組NrdH-redoxin。純化蛋白的氧化還原活性通過(guò)二硫蘇糖醇還原牛胰島素的反應(yīng)得到證實(shí)。我們研究了過(guò)表達(dá)該酶對(duì)宿主菌的影響，包括過(guò)表達(dá)NrdH-redoxin對(duì)宿主菌生長(zhǎng)的影響以及過(guò)表達(dá)NrdH-redoxin的宿主菌對(duì)抗氧化壓力的耐受性研究。
　　 運(yùn)用Vect

7、or NTI9，SignalP，swiss model等生物信息學(xué)資源對(duì)NrdH-redoxin的基本性質(zhì)進(jìn)行了分析，包括對(duì)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)(親水性/疏水性，跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽等)；二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)等基本性質(zhì)的預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明：結(jié)核分枝桿菌H37RvNrdH-redoxin無(wú)信號(hào)肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；二級(jí)結(jié)構(gòu)是由3個(gè)α螺旋及4個(gè)β折疊片等構(gòu)成。同時(shí)在一、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，利用同源建模的方法完成了其三維結(jié)構(gòu)的建模。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫(kù)中搜尋

8、模板，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌H37Rv NrdH-redoxin的1-72位氨基酸殘基肽段與產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)的NrdH-redoxin(PDB登陸號(hào)為lr7hA)的序列一致性高達(dá)73.611％。利用比較基因組學(xué)分析該蛋白在分枝桿菌屬中的同源和分布情況，結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌H37RvNrdH-redoxin同已報(bào)道的其他分枝桿菌屬來(lái)源的NrdH-redoxin有較高的同源性。NrdH-redo

9、xin的三種特征序列基序在這些物種中都存在，除了三株能降解多環(huán)芳烴的分枝桿菌(包括Mycobacterium sp.MCS，Mycobacterium sp.KMS和Mycobacterium sp.JLS)以外，其它分枝桿菌中的序列是高度一致的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同分枝桿菌的nrdH基因組合方式也較為保守，nrdH、nrdI和nrdE三個(gè)基因緊密相連，很可能是共轉(zhuǎn)錄的；在編碼核苷酸還原酶(ribonucleotidereductase，

10、RNR)α亞基的nrdE基因和編碼核苷酸還原酶β亞基的nrdfF基因中間還有兩個(gè)ORF，主要是假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子和單加氧酶。在非致病的分枝桿菌中，nrdH基因的組合方式更為保守，在nrdHIE基因上游普遍存在一個(gè)NADPH依賴(lài)型的黃素單核苷酸還原酶。但在致病的分枝桿菌中，在nrdH周?chē)纳舷掠位蛑写蟛糠质蔷幋a一些功能未知的蛋白，所以其功能也有待進(jìn)一步研究。綜上，本研究為揭示結(jié)核分枝桿菌NrdH-redoxin的生理功能及其抗氧化應(yīng)激機(jī)制