結(jié)核分枝桿菌GlmU在恥垢分枝桿菌中的高表達(dá)及反義RNA表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化.pdf

1、由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的三大疾病之一。世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO）的報(bào)告顯示，世界人口的三分之一感染過結(jié)核桿菌，全世界每20秒就有一人死于結(jié)核病。由于耐多藥（multidrugresistant，MDR）甚至是廣泛耐藥（extensivedrugresistant，XDR）結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，許多一線甚至一些二線抗結(jié)核藥物都無法有效治療結(jié)核病，因此尋找新的抗結(jié)核藥物迫在眉睫。

2、 結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁在其生存和增殖過程中起著重要的作用，其核心結(jié)構(gòu)由肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖、分枝菌酸三種組分連接組成。其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通過銜接雙糖（L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺）共價連接到肽聚糖分子上。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供體，在UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成中，glmU基因編碼的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶活性，催化最后兩步反應(yīng)。

3、本實(shí)驗(yàn)室張文利通過基因敲除的方法證明了glmU基因?yàn)榉种U菌生長必需基因，因此，GlmU可作為很好的抗結(jié)核新藥靶標(biāo)。 本實(shí)驗(yàn)己建立了測定GlmU酶活性的方法，并以此作為篩選抗GlmU酶抑制劑的分子模型。因此，我們需要構(gòu)建能上調(diào)GlmU蛋白表達(dá)的細(xì)胞模型來進(jìn)一步篩選抗GlmU酶抑制劑。另外，為了進(jìn)一步研究GlmU蛋白表達(dá)的下降對分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響，我們需要構(gòu)建能下調(diào)GlmU蛋白表達(dá)的系統(tǒng)，來下調(diào)GlmU蛋白表達(dá)水平，并用本實(shí)

4、驗(yàn)制備的抗GlmU的多克隆抗體對glmU反義RNA表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的GlmU水平進(jìn)行檢測。 本論文的目的是：（1）在宿主菌mc2155中高表達(dá)TbGlmU，并用檢測GlmU酶蛋白活性的方法來鑒定TbGlmU在恥垢中的高表達(dá)；（2）優(yōu)化受四環(huán)素誘導(dǎo)的glmU反義RNA表達(dá)系統(tǒng)，用本實(shí)驗(yàn)室制備的GlmU多克隆抗體檢測GlmU蛋白的表達(dá)水平；（3）用掃描電鏡觀察GlmU表達(dá)減弱的恥垢分枝桿菌形態(tài)學(xué)變化。 本論文所獲得的結(jié)果如下：

5、 1.表達(dá)載體pVV2-TbglmU的構(gòu)建用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切pET16b-TbglmU質(zhì)粒，回收和純化glmU基因，將其連接到pVV2表達(dá)載體的NdeⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建pVV2-TbglmU表達(dá)質(zhì)粒。GlmU蛋白的N端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。 2.TbGlmU蛋白在恥垢分枝桿菌mc2155中的高表達(dá)及鑒定將pVV2-TbglmU質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc2155感受態(tài)細(xì)胞中使其表達(dá)GlmU蛋白。用超聲方法破

6、碎攜帶pVV2-TbglmU的mc2155菌，對上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblotting分析，結(jié)果表明TbGlmU蛋白在mc2155中可溶性表達(dá)。并利用其酶活性檢測方法來鑒定GlmU在恥垢分枝桿菌中的高表達(dá)。 3.反義RNA表達(dá)載體pMind-SmglmU（360bp）-AS的構(gòu)建用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切pMD18-SmglmU（360bp）質(zhì)粒，回收和純化glmU基因片段，將其連接到pMind反義

7、表達(dá)載體的NdeⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建pMind-SmglmU（360bp）-AS反義表達(dá)質(zhì)粒。 4.glmU反義RNA的誘導(dǎo)表達(dá)與GlmU蛋白的檢測分別用0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml的四環(huán)素誘導(dǎo)攜帶pMind-SmglmU（360bp）-AS表達(dá)載體的mc2155菌株表達(dá)反義RNA，繪制細(xì)菌生長曲線，并用本實(shí)驗(yàn)室制備的GlmU多克隆抗體檢測GlmU蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明20ng/ml四環(huán)素對mc2155/pM

8、ind-SmglmU（360bp）-AS的生長有明顯的抑制作用，Westernblotting結(jié)果表明經(jīng)過20ng/ml四環(huán)素誘導(dǎo)的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-ASGlmU蛋白的表達(dá)明顯減少，證明了glmU反義RNA下調(diào)了恥垢分枝桿菌GlmU表達(dá)水平。 5.經(jīng)20ng/ml四環(huán)素誘導(dǎo)的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-AS菌株細(xì)胞形態(tài)的變化將經(jīng)20ng/ml四環(huán)素誘導(dǎo)的mc2155/

9、pMind-SmglmU（360bp）-AS菌株細(xì)胞用掃描電鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示生長了48小時后，菌體表面出現(xiàn)明顯的凸起，甚至溶脹，菌體輪廓亦不清晰，似乎都粘連在一起。說明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的反義RNA表達(dá)系統(tǒng)發(fā)揮了下調(diào)GlmU表達(dá)的作用，更進(jìn)一步說明了GlmU蛋白對細(xì)胞壁完整性有影響。 結(jié)論： 1.在恥垢分枝桿菌中高表達(dá)出可溶性TbGlmU蛋白，構(gòu)建了能上調(diào)GlmU表達(dá)的菌株，為篩選TbGlmU酶抑制劑提供了細(xì)胞模型。