結核分枝桿菌furb基因的克隆、表達和純化

1、<p>　　結核分枝桿菌furB基因的克隆、表達和純化</p><p>　　作者：姜泓，薛瑩，高雪，師長宏，柏銀蘭，張海，李元，徐志凱 </p><p>　　【關鍵詞】 結核分枝桿菌 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To obtain Mycobacterium tuberculosis (MTB) furB from H37Rv

2、DNA, express efficiently in E. coli and purify the FurB proteins. METHODS: furB was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEMTEasy vector. After sequenced, furB was recombinated into the expression

3、vector pQE80L by restriction enzyme digestion, which was named pQE80LfurB. The plasmid pQE80LfurB was transformed into E.coli DH5α and induced by IPTG. The furB expression was analyzed by SDSPAGE and confir</p>&l

4、t;p>　　【Keywords】 furB; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis </p><p>　　【摘要】 目的： 從H37Rv基因組中擴增furB并高效表達和純化. 方法： 用PCR技術從結核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增furB序列，將其與pGEMTEasy載體連接轉化E.coli DH5α，構建重組克隆載體pGEMTEasy/

5、furB，測序正確后將目的基因片斷克隆入pQE80L原核表達載體并轉化E.coli DH5α，IPTG誘導目的蛋白表達. 經Western blot鑒定目的基因與(His)6融合表達，將已表達的蛋白質通過Ni2+NTA親和色譜柱進行純化. 結果： PCR得到結核分枝桿菌furB，測序結果與Genbank中報道的完全一致. SDSPAGE顯示，在Mr為15.0×103處有相應的蛋白質表達條帶，Western blot鑒定為(Hi

6、s)6融合表達蛋白. 經Ni2+NTA親和色譜柱進行純化后可得到純化的蛋白. 結論： 成功克隆了鐵調節(jié)蛋白基因furB序列，并在E.coli DH5α高效表達，親和層析后獲得了純化目的蛋白. </p><p>　　【關鍵詞】 furB;表達;純化;結核分枝桿菌 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　結核分枝桿菌（M

7、ycobacterium tuberculosis, MTB）在結核病(tuberculosis, TB)患者體內的生長與鐵的利用有關. 研究發(fā)現(xiàn)，MTB基因組包含了兩個相似的鐵攝取基因furA和furB. furA主要與其下游的katG基因表達有關, 而furB的功能現(xiàn)在還不清楚．為此，我們在原核表達載體中表達MTB furB并對其進行了純化，為其功能研究奠定基礎. </p><p><b>　　1材

8、料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　MTB毒株H37Rv, DH5α由本室保存; pGEMTEasy及Wizard Plus Purification system購自Promega公司； Xgal, 限制性內切酶BamHⅠ, HindⅢ及T4DNA連接酶，TaqDNA聚合酶均為TaKaRa公司產品；I

9、PTG, DTT, DTE,小量質粒提取試劑盒均為Sigma公司產品，膠回收試劑盒為Vitagene公司產品. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1引物的設計與合成根據(jù)已發(fā)表的MTB H37Rv全基因組furB編碼區(qū)(2641648N,2642040C)序列設計引物. 上游引物P1: 5′GGATCCAGTGCAGCCGG

10、TGTCCGC3′中加入BamHⅠ酶切位點；下游引物P2: 5′AAGCTTCCTTTTGGTGCTGGAGACGG3′ 中加入HindⅢ酶切位點. 引物由上海博亞生物技術有限公司合成. </p><p>　　1.2.2furB片段的擴增取保存于改良羅氏培養(yǎng)基的MTB H37Rv接種于7H9液體培養(yǎng)基，37℃間或振蕩培養(yǎng)2~3 wk. 取5 mL液體培養(yǎng)物的菌體沉淀重懸于50 μL裂解液（10×PCR綬

11、沖液5 μL, 45 g/L吐溫5 μL, 45 g/L NP40 5 μL, 20 g/L蛋白酶K 0.5 μL及水34.5 μL）中. 于55℃水浴1 h，沸水浴10 min滅活蛋白酶K，離心取上清，用酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀，溶于50 μL TE中［1］,作為DNA模板. PCR反應體系為： 10×buffer 5 μL, dNTPs 5 μL (2.5 mmoL/L)、DNA模板為1 μL, P1, P2引物各1

12、μL (25 μmoL/L)及Taq酶1 μL，加水至50 μL. PCR條件: 94℃變性40 s，56℃復性30 s，72℃延伸50 s, 25個循環(huán). </p><p>　　1.2.3PCR產物的克隆與鑒定PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳回收DNA條帶. 取純化的PCR產物與質粒pGEMTEasy進行連接反應，轉化感受態(tài)DH5α, 均勻涂布于含有xgal(33 μL) 和異丙基βD硫代半乳糖苷IPTG(20

13、μL)的LB培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)16 h, 挑取白色菌落進行酶切鑒定，所獲陽性克隆命名為pGEMTEasyfurB，送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定. </p><p>　　1.2.4目的蛋白的誘導表達經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與經同樣酶切的pQE80L載體進行連接反應， 轉化感受態(tài)DH5α，挑取的陽性克隆命名為pQE80LfurB. 在含有氨芐青霉素（100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)pQE

14、80LfurB. 按10%的接種量進行轉接，37℃搖菌3 h，加入異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5 mmoL/ L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4~5 h. 取1.5 mL細菌培養(yǎng)物，8000 g離心30 s收集菌體，加入2×樣品緩沖液劇烈振蕩混勻，100℃, 5 min；8000 g離心5 min；取上清進行 SDSPAGE電泳檢測. </p><p>　　1.2.5表達產物鑒定將經誘導的pQE8

15、0LfurB和E.coli DH5α分別制樣，進行Western blot分析. </p><p>　　1.2.6表達蛋白的可溶性分析大規(guī)模培養(yǎng)細菌，誘導表達目的蛋白，收集細菌，超聲破菌. 離心后將上清和沉淀分別制樣，進行SDSPAGE分析. </p><p>　　1.2.7表達產物的純化根據(jù)Ni2+NTA試劑盒的說明書, 將融合蛋白與Ni2+NTA結合, 用不同pH值咪唑溶液進行洗脫,

16、得到純化產物. </p><p><b>　　2結果 </b></p><p>　　2.1furB片段的擴增及序列測定經25個循環(huán)PCR擴增，可得與預計長度相等的片斷（Fig 1）. 將DNA回收后插入pGEMTEasy載體，經測序證實所擴增的furB序列與Genbank數(shù)據(jù)庫所收錄的furB序列完全一致. </p><p>　　2.2表達載體

17、的構建pQE80L經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與furB目的片斷進行連接反應后，轉化感受態(tài)E.coli DH5α. 挑取的克隆子進行酶切鑒定，切出約561 bp大小片段的為陽性克隆子(Fig 2 )，命名為pQE80L furB. </p><p>　　2.3furB在pQE80L表達載體中的誘導表達將pQE80LfurB經37℃活化過夜，經IPTG誘導表達后做SDSPAGE分析，從電泳圖中可以看出在Mr為1

18、5.0×103處出現(xiàn)了一條表達帶，表達量約占菌體總蛋白的20% (Fig 3). </p><p>　　2.4目的蛋白的鑒定所構建的重組質粒表達的FurB蛋白以帶有6個組氨酸的融合蛋白的形式出現(xiàn)，使用鼠抗 (His)6 mAb驗證FurB蛋白的表達. 結果顯示在Mr為15.0×103處有一顯色帶，而對照無相應條帶 (Fig 4). </p><p>　　2.5表達蛋白的

19、可溶性分析將上清和沉淀分別所制樣品，進行SDSPAGE分析表明表達產物主要在細菌裂解后的沉淀中，而上清中則很少(Fig 5). </p><p>　　2.6目的蛋白的純化純化的產物經SDSPAGE分析可在Mr為15.0×103處得到一條清晰的條帶(Fig 6). </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　由于

20、BCG免疫效果極不穩(wěn)定［2］，缺乏對MTB致病機制的深刻了解，現(xiàn)在全球已處于結核病的緊急狀態(tài)［3］. 入侵機體的MTB和宿主的關系是動態(tài)的，必須快速適應不利并不斷變化的環(huán)境. 金屬離子的獲取對病原菌的復制增殖是必需的. 鐵是多種酶的輔因子，參與電子轉運和氧化還原反應［4］，在MTB的生長過程中發(fā)揮了重要作用. 限制鐵的利用可以延緩MTB的生長，同時鐵的利用情況可作為反映幾種毒性因子表達水平的指標［5］. 相反，鐵的無限制地攝取會導致鐵中

21、毒和氧化應激從而使細菌停止生長［6］. 病原菌的金屬調控蛋白主要有四個不同的簇組成，分別為Fur(ferric uptake regulator), DtxR(diphtheria toxin repressor), MerR和ArsR. MTB基因組包含了兩個相似的鐵攝取基因furA和furB, furA位于katG上游［7］，并與katG其表達調控有關, 而furB的功能還不清楚. 基因序列分析，MTB基因組中的furB比furA更

22、相似于大腸桿菌fur, 因此furB可能是細胞內多種基因表達的一個調控因子. </p><p>　　本實驗中應用的pQE80L表達載體為4751 bp，起始碼下游接有6個組氨酸，雙鏈環(huán)狀，Amp抗性，多克隆位點有9個單一限制性酶切位點. PCR產物共有561 bp,其中furB本身有393個堿基，在其終止碼的下游的168個堿基為非編碼序列. 因此，furB克隆入pQE80L載體中與6個組氨酸融合，可產生共137個

23、氨基酸的融合蛋白，Mr為15.0×103左右，實驗結果與理論值相符合. 融合蛋白有(His)6的表達，因此通過檢測組氨酸的表達，可間接證明furB表達，同時(His)6的表達為進一步純化蛋白提供了親和位點，它可與Ni2+特異性結合，通過Ni2+NTA親和色譜柱可得到純化的目的蛋白. </p><p>　　我們成功地在原核表達系統(tǒng)中表達MTB的鐵調控相關蛋白FurB, 并進行了初步鑒定和純化,為進一步研究

24、FurB的功能奠定了基礎. </p><p><b>　　【參考文獻】 </b></p><p>　?。?］ 范雄林，徐志凱，李元，等. 結核分枝桿菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］. 第四軍醫(yī)大學學報，2001;22(14):1283-1287. </p><p>　　Fan XL, Xu ZK, Li Y, et al. Gene vacc

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