結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因克隆、表達(dá)、及免疫活性研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuherculosis MTB)所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。目前全球有1/3的人口感染過(guò)MTB，每年有800萬(wàn)新感染患者和300萬(wàn)患者死亡，表明TB仍是影響全球人類健康的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái)，由于預(yù)防疫苗卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)保護(hù)性不完善、耐藥MTB流行、與人類免疫缺陷病毒(Human i

2、mmunodificiciency Virus，HIV)的協(xié)同感染以及人口流動(dòng)等原因使TB疫情日益嚴(yán)重。結(jié)核病現(xiàn)臨床常用的診斷篩選方法是用純化的結(jié)核菌素蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，PPD)進(jìn)行的皮膚試驗(yàn)，但是PPD是一種成分復(fù)雜的蛋白混合物，除了含有牛分支桿菌特異性分泌抗原外，還含有許多其他分支桿菌具有的類屬抗原，因此交叉反應(yīng)無(wú)法避免，而且早期感染抗體水平較低，使診斷試

3、劑特異性不高，TB病例的及時(shí)發(fā)現(xiàn)成為難題。鑒于以上問(wèn)題，TB新型疫苗或增強(qiáng)BCG免疫效果以及特異、快速診斷試劑的研究具有重要意義。 MTB的保護(hù)性抗原存在于其短期培養(yǎng)物濾液(ST-CF)中。ST-CF主要是由MTB在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的分泌性分子及胞內(nèi)釋放出的某些分子組成，含有200多種多肽。其中早期分泌性抗原靶6(early secretory antigen target6，ESAT-6)是MTB感染早期介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要優(yōu)

4、勢(shì)抗原，可被感染了結(jié)核桿菌的動(dòng)物或病人有免疫活性的T淋巴細(xì)胞所識(shí)別，并產(chǎn)生高水平的IFN-γ，IFN-γ可顯著活化巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)MTB的生長(zhǎng)抑制作用和殺傷能力。ESAT-6蛋白僅存于致病的MTB中，在各種BCG菌株中均缺失。 本研究通過(guò)PCR從MTB H37Rv株基因組中擴(kuò)增出編碼ESAT-6蛋白的基因，構(gòu)建了pGEX-4T-1-ESAT-6原核表達(dá)載體，經(jīng)Western-Blot檢測(cè)表明成功表達(dá)該蛋白。表達(dá)蛋白以

5、包涵體形式表達(dá)。以兩種方式回收目的蛋白，一種是通過(guò)研磨SDS-PAGE凝膠表達(dá)帶收集勻漿上清液。另一種是通過(guò)包涵體變性、復(fù)性、Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析獲得EGAT-6蛋白。在上述研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)還初步研究了ESAT-6蛋白的免疫學(xué)活性。采用皮下注射的方法，用預(yù)先通過(guò)兩種方式收集的表達(dá)蛋白免疫小鼠，同時(shí)設(shè)BCG免疫陽(yáng)性和空白組。免疫完成后，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)免疫小鼠血清中特異性的抗ESAT-6抗體，最高滴度達(dá)到為1:64

6、。并且通過(guò)MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞非特異性和特異性增殖反應(yīng)，分離小鼠的脾淋巴細(xì)胞，正常鼠用ConA和ESAT-6刺激，刺激指數(shù)分別為2.54和1.93，說(shuō)明該蛋白具有直接刺激T細(xì)胞免疫的活性。免疫鼠用特異性抗原PPD，ESAT-6蛋白(SDS-PAGE回收、SephadexG-200回收)刺激，刺激指數(shù)分別為2.27、1.68和1.87。ESAT-6蛋白免疫組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均低于BCG組，說(shuō)明單一蛋白免疫效果與BCG相比仍有很大差距。由于ESAT

7、-6蛋白在各種BCG菌株中缺失，而且在結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌中同源性達(dá)到100％，許多研究已經(jīng)證實(shí)是非常有前景的鑒別診斷候選抗原。本研究采用該抗原建立結(jié)核病的間接ELISA檢測(cè)方法，旨在為臨床結(jié)核病的診斷提供一種特異性，敏感性和實(shí)用性都比較理想的診斷試劑。首先是建立結(jié)核特異性抗體ELISA檢測(cè)方法，本研究在前人工作的基礎(chǔ)上對(duì)抗原包被濃度和血清稀釋度、封閉液、底物作用時(shí)間及陰陽(yáng)判定等方面作了摸索和改進(jìn)。改進(jìn)后的ELISA陰性背景降低

8、，血清稀釋液簡(jiǎn)化，結(jié)果判定更為科學(xué)。其次是應(yīng)用結(jié)核特異性抗體ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行臨床試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的1000份臨床樣品的檢測(cè)，及用PPD抗原和ESAT-6抗原同時(shí)包被，比較兩者的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明兩者檢測(cè)的結(jié)果存在著一定的差異。說(shuō)明該ELISA方法和該抗原在結(jié)核病的早期診斷和適時(shí)監(jiān)測(cè)具有很大的發(fā)展前景。 綜上所述，本研究通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)MTB分泌性ESAT-6蛋白。重組蛋白免疫小鼠后，可在小鼠體內(nèi)引發(fā)保護(hù)性免疫