恥垢分枝桿菌MSMEG-6402基因的克隆、表達及功能鑒定.pdf

1、結核病(Tuberculosis，TB)主要是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的，多種耐藥性結核菌株的出現(xiàn)以及臨床抗結核藥物的缺乏，致使結核病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尋找新的藥物靶點、開發(fā)能有效治療多重耐藥結核的抗結核藥物亟待解決。
　　 細胞壁是分枝桿菌賴以生存的重要屏障，而聚阿拉伯糖是細胞壁的核心組分。聚阿拉伯糖基的活性供體被證實是聚十異戊二烯磷酸阿拉伯糖（Decapreny

2、l-phospho-arabinose，DPA）。近幾年，隨著磷酸核糖轉移酶(Rv3806c)和差向異構酶（Rv3790/Rv3791）功能的揭示，DPA特異的合成途徑逐漸被闡明，是由三個連續(xù)反應組成:(1)Rv3806c催化5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）轉移到聚十異戊二烯磷酸(DP)分子上形成5-磷酸核糖聚十異戊二烯磷酸(5-P-DPR);(2)磷酸酶催化5-P-DPR分子上的5-磷酸基團水解形成聚十異戊二烯磷酸核糖(DPR);(3)

3、Rv3790/Rv3791催化DPR生成DPA。在此途徑中，催化5-P-DPR脫磷酸的磷酸酶尚未被鑒定。而與Rv3806c處于同一啟動子的Rv3807c通過蛋白結構域預測具有磷酸酶功能結構域，該蛋白被推測催化5-P-DPR生成了DPR。非致病菌恥垢分枝桿菌的MSMEG-6402基因是Rv3807c基因的同源基因，本論文通過在大腸桿菌BL21(DE3)中將MSMEG-6402基因克隆、可溶性表達并純化，建立MSMEG-6402蛋白的體外酶

4、活測定方法，對MSMEG_6402的功能進行闡明，這將有助于完善對于DPA合成代謝途徑的認識以及尋找新型抗結核藥物靶點。
　　 本研究的實驗內(nèi)容包括:1）構建pET16b-MSMEG-6402表達質粒，在BL21(DE3)中進行可溶性表達，并用鎳-組氨酸親和層析法對帶有N-末端組氨酸標簽的MSMEG-6402蛋白進行純化，通過SDS-PAGE和Western-blotting對表達蛋白和純化蛋白進行檢測鑒定;2）由于5-P-DP

5、R反應直接底物的缺乏，需要偶聯(lián)Rv3806c參與的酶促反應來完成酶活檢測，因此我們采用與MSMEG-6402相同的表達載體和菌株對Rv3806c蛋白進行可溶性表達并純化，通過SDS-PAGE和Western-blotting進行檢測鑒定;3）根據(jù)底物DP/PRPP和產(chǎn)物DPPR/DPR的性質及其消耗產(chǎn)出量的變化，分別采用孔雀石綠-鉬酸銨測磷法、薄板層析法(TLC)以及質譜法(MS)對MSMEG-6402純化蛋白的功能活性進行檢測。

6、>　　 研究結果如下:
　　 1)成功對MSMEG-6402基因和Rv3806c基因在大腸桿菌BL21(DE3)中進行可溶性表達，通過Ni-NTA純化獲得目的蛋白，分子量分別為20kDa和33kDa;
　　 2)建立MSMEG-6402蛋白功能活性的測定方法，對其磷酸酶活性進行鑒定:孔雀石綠-鉬酸銨測磷法對反應生成的游離單磷酸進行檢測，觀察到MSMEG-6402蛋白參與的反應組明顯的顏色和OD630值變化，陰性對照組與

7、空白對照組結果相近;TLC法對反應產(chǎn)物DPPR和DPR進行檢測，由于二者均為糖脂化合物，同時采用糖顯色和脂顯色，以DP和PRPP為底物對照，樣品組有DPPR和DPR的生成，而陰性對照組只有DPPR的生成;MS法對底物DP/PRPP的消耗量和產(chǎn)物DPPR/DPR的生成量進行直接檢測，結果顯示DP/PRPP有一定量的消耗，同時DPPR/DPR有相應的峰出現(xiàn)。
　　 綜上所述，本研究利用不同的方法對MSMEG-6402蛋白的功能進行了