Der p2重組BCG對哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用及其機制的研究.pdf

1、哮喘是一種以可逆性氣道阻塞、嗜酸性粒細胞性氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的慢性氣道疾病?？乖禺愋訡D4+Th2細胞產生的大量IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子直接導致了哮喘的各種病理生理改變。此外，哮喘的發(fā)病與環(huán)境變應原誘導的速發(fā)型超敏反應直接相關。其中，屋塵螨抗原是最重要的誘發(fā)哮喘的室內變應原。
　　構建變應原重組免疫調節(jié)疫苗，轉變有害的變應性Th2免疫應答為保護性免疫應答、進而改變哮喘疾病進程、從而獲得滿意長期

2、療效的治療策略是哮喘基礎和臨床研究的一個重要方向。我們課題組前期構建了胞壁表達屋塵螨抗原Derp2的重組BCG疫苗（Derp2recombinedBCG）。隨后的研究證實，該rBCG可誘導naive小鼠發(fā)生Th2向Th1方向的免疫偏移。但是，Derp2rBCG在小鼠哮喘模型中的免疫調節(jié)作用仍不清楚。
　　BCG是廣泛應用的Th1應答誘導疫苗。幾項研究表明BCG可通過誘導Th2向Th1方向的免疫偏移治療哮喘等變應性疾病。但是近年來有

3、研究認為分枝桿菌下調哮喘氣道炎癥與其作為免疫佐劑誘導生成Tregs有關，而與免疫偏移無關。因此，BCG/rBCG抑制哮喘氣道炎癥的免疫學機制有待進一步的研究。
　　Notch是一條高度保守的調控細胞增殖和分化的信號通路。Notch配體和受體之間的相互作用可以觸發(fā)受體釋放胞內段NIC進入胞漿。NIC轉位至核內并與轉錄因子RBP-J結合。RBP-J進一步調控Hes家族分子等下游基因的表達。Hes蛋白是抑制性bHLH分子，可抑制許多bH

4、LH家族分子的表達。
　　Notch信號調控著T細胞發(fā)育多個階段的譜系決定過程。有研究提示Notch信號參與了Tregs的分化過程。但是Notch信號在nTregs的發(fā)育和功能維持中具體作用仍不清楚。Foxp3是調控nTregs發(fā)育和功能的關鍵分子。Notch信號是否可以直接調控Foxp3的表達及其機制如何仍不清楚。
　　本研究的目的是：（1）觀察Derp2rBCG對哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用并探討其免疫學機制；（2）觀察N

5、otch信號對Foxp3表達的調控作用并闡明其調控機制。其主要研究成果如下：
　　1．證實了在OVA及Derp2兩種變應原誘導的哮喘小鼠模型中，Derp2rBCG免疫可以下調氣道局部的炎癥細胞浸潤，肺組織病理形態(tài)學改變，粘液高分泌及肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象。對BALF中Th2類細胞因子表達譜的檢測分析表明Derp2rBCG減少了IL-4、IL-5和IL-13的產生。所以，Derp2rBCG可以有效下調哮喘變應性Th2免疫應答。
　

6、　2．通過對哮喘小鼠BALF中IFN-γ/IL-4及肺組織中IFN-γ/IL-4mRNA的分析，發(fā)現(xiàn)Derp2rBCG免疫可誘導哮喘小鼠發(fā)生Th2向Th1方向的免疫偏移，改變氣道局部及全肺組織中的Th2細胞因子極化環(huán)境。
　　3．發(fā)現(xiàn)Derp2rBCG上調了Derp2誘導的哮喘小鼠BALF中TGF-β的水平；Derp2rBCG免疫增加了小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的相對比例和絕對數(shù)量；Derp2rBCG誘導產生的

7、CD4+CD25+T細胞可以在體外以抗原特異性的方式抑制效應CD4+T細胞的增殖；過繼轉移Derp2rBCG誘導產生的CD4+CD25+T細胞可定向遷移至受體哮喘小鼠胸腔局部引流淋巴結下調氣道局部炎癥。因此，Derp2rBCG對哮喘氣道炎癥的下調作用也與其誘導的Tregs介導的免疫抑制有關。
　　4．通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在小鼠和人FOXP3啟動子中均存在假定的RBP-J結合位點和Hes結合位點。進一步通過報告基因實驗證實了異位過

8、表達NIC可以增強FOXP3啟動子活性。DNApull-down實驗表明NIC-RBP-J復合物可以與FOXP3啟動子中的RBP-J結合位點結合。GSI阻斷Notch信號后CD4+CD25+Tregs中Foxp3的表達下調。因此，Notch信號可以直接調控Foxp3的表達。但ChIP分析表明在CD4+CD25-T細胞中NIC-RBP-J復合物也與FOXP3啟動子結合在一起，提示Notch信號并沒有參與Tregs發(fā)育的譜系形成過程。

9、>　　5．構建了一系列RBP-J結合位點和N-box位點的截短及點突變的報告基因質粒。通過報告基因發(fā)現(xiàn)，NIC-RBP-J復合物是FOXP3啟動子的反式激活因子，而Hes1是反式阻遏因子。Westernblot證實在高劑量NIC下調FOXP3啟動子活性時，Hes1被誘導表達。因此，Notch信號以雙相性的方式調節(jié)FOXP3啟動子的活性：低水平的Notch信號通過NIC-RBP-J復合物增強FOXP3啟動子活性，而高水平的Notch信號通

10、過Hes1下調了FOXP3啟動子活性。
　　6．通過ChIP實驗發(fā)現(xiàn)Hes1僅在CD4+CD25-T細胞中與FOXP3啟動子結合，在Tregs中anti-Hes1并不能沉淀出FOXP3啟動子中的相應染色質片斷。同時，點突變報告基因實驗表明Hes1對FOXP3啟動子活性有顯著的抑制作用。所以Hes1可能是Tregs發(fā)育的譜系決定過程中轉錄因子水平的一個重要調控因子。
　　綜上所述，我們證實了自行構建的Derp2rBCG可以有效

11、下調哮喘變應性Th2免疫應答，其介導的免疫調節(jié)過程同時涉及了免疫抑制和免疫偏移兩種機制。這些發(fā)現(xiàn)提供了又一個可行的哮喘免疫調節(jié)治療方法，并在一定程度上豐富了哮喘免疫學發(fā)病機制。我們還發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可以通過RBP-J和Hes1依賴的機制雙相性的直接調控FOXP3啟動子活性，Hes1可能是Tregs發(fā)育的譜系決定過程中轉錄因子水平的一個重要調控因子。這部分研究結果為nTregs的發(fā)育分化機制研究提供了一條新的重要線索，并在一定程度上