重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、保護(hù)力及對感染小鼠的免疫治療作用.pdf

1、背景：
　　恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一種生長快、轉(zhuǎn)化效率高的非致病性分枝桿菌。研究顯示其1-3小時便可繁殖一代，生長速率是卡介苗（BCG）的10倍。低劑量的恥垢分枝桿菌對人、小鼠和豚鼠均不致病，并能很快被機(jī)體清除。恥垢分枝桿菌表達(dá)外源蛋白的水平可達(dá)結(jié)核分枝桿菌（MTB）的5-10倍，單位時間內(nèi)分泌的蛋白產(chǎn)量比MTB高50-100倍?；谝陨蟽?yōu)勢，恥垢分枝桿菌有望成為代替BCG的有效疫苗

2、載體。已有的研究證實，MTB肝素結(jié)合血凝素（HBHA）抗原對 MTB感染具有明確的治療效果，而人白介素12（hIL-12）在針對胞內(nèi)菌的細(xì)胞免疫中起著關(guān)鍵作用。因此，構(gòu)建表達(dá)HBHA與hIL-12融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌可通過融合基因表達(dá)產(chǎn)物有效提高單個優(yōu)勢抗原的免疫原性；另一方面，重組恥垢分枝桿菌能夠集中靶抗原和活載體的優(yōu)勢，可能提高HBHA誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的水平和保護(hù)力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對體內(nèi) MTB的清除作用。
　　目的：

3、
　　采用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)HBHA與hIL-12融合基因的重組恥垢分枝桿菌，并通過檢測其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、保護(hù)力和對感染小鼠的免疫治療作用，以期為結(jié)核病的預(yù)防和治療提供新的有效候選疫苗。
　　實驗方法和結(jié)果：
　　1.重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建及鑒定
　　根據(jù)GeneBank中查找到的結(jié)核分枝桿菌肝素結(jié)合血凝素（hbha）基因及人白介素12（hil-12）基因，分別設(shè)計兩段基因的引物，用分子生物學(xué)技

4、術(shù)構(gòu)建分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒 pSMT3-HBHA-hIL12，并用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌中。采用免疫熒光法和蛋白質(zhì)印跡（Western blot），分別檢測HBHA和hIL-12蛋白在重組恥垢分枝桿菌中的表達(dá)，并通過檢測培養(yǎng)物OD600的吸光度，確定重組恥垢分枝桿菌生長狀態(tài)未發(fā)生明顯改變。
　　2.重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及保護(hù)力
　　將表達(dá)HBHA和hIL-12融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌采用同源

5、加強(qiáng)免疫的方法免疫小鼠，測定重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，檢測小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表達(dá)水平和CD4+、CD8+T細(xì)胞在外周血中所占的比例。并用結(jié)核分枝桿菌感染免疫小鼠，通過檢測小鼠肺部荷菌量和組織病理變化評價該重組恥垢分枝桿菌誘導(dǎo)的保護(hù)力。結(jié)果顯示重組恥垢分枝桿菌誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以IFN-γ、IL-2分泌量增加為主的Th1型免疫應(yīng)答，能有效減少感染小鼠肺部結(jié)核分枝桿菌的荷菌量，并能有效減輕其病理

6、損傷，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用，因此該重組恥垢分枝桿菌可能成為控制結(jié)核病的有效疫苗。
　　3.重組恥垢分枝桿菌對感染小鼠的治療作用
　　結(jié)核分枝桿菌感染小鼠4w后，皮下接種重組恥垢分枝桿菌，檢測免疫小鼠肺部荷菌量和組織病理變化。結(jié)果顯示，重組恥垢分枝桿菌雖然不及化療藥物顯著降低肺部荷菌量，但可以有效控制感染小鼠肺部結(jié)核分枝桿菌的荷菌量并減輕病理損傷。
　　結(jié)論：
　　表達(dá)HBHA和hIL-12融合蛋白的