靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物分枝桿菌感染免疫發(fā)病機(jī)制及免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、分枝桿菌感染的免疫發(fā)病機(jī)制研究 目的：全面系統(tǒng)的了解分枝桿菌感染后機(jī)體的免疫反應(yīng)。方法：以靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物為模型，采用靜脈注射的方式感染BCG，然后在不同時(shí)間點(diǎn)抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的外周血，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)得到BAL液。采用全血染色、BAL液細(xì)胞染色、分離外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)(ELISPOT)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)及外周血BCG菌落(CFU)計(jì)數(shù)等方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能進(jìn)行

2、了全面分析。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在感染BCG后，外周血和局部組織中的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及亞群分布變化不大，但對(duì)分枝桿菌特異性抗原，PPD的反應(yīng)大大增強(qiáng)，且可持續(xù)六周。而外周血和局部組織中Vγ2V82+T細(xì)胞數(shù)量在BCG感染后第三、四周后均明顯增加，并且以效應(yīng)細(xì)胞(EM)增加為主，同時(shí)對(duì)分枝桿菌特異性抗原，HMBPP的反應(yīng)顯著增強(qiáng)，且持續(xù)長(zhǎng)達(dá)十余周。同時(shí)外周血BCG CFU計(jì)數(shù)也于第三周開(kāi)始消失。結(jié)論：CD3+CD4

3、+、CD3+CD8+及V72V82+T細(xì)胞均參與了機(jī)體對(duì)分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)，其中以Vγ2V82+T細(xì)胞的變化最為顯著。因此Vγ2V82+T細(xì)胞很有可能在分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中起著相當(dāng)重要的作用。 第二部分、HMBPP免疫藥效動(dòng)力學(xué)研究 目的：了解HMBPP(4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphate)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞的作用。方法：以靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物為模型，先用HMB

4、PP在體外刺激其PBL，了解Vγ2V82+T細(xì)胞增殖情況。然后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：對(duì)照組、HMBPP組、IL-2組和HMBPP+IL-2組。對(duì)相應(yīng)動(dòng)物給予肌注HMBPP和/或皮下注射IL-2，然后在不同時(shí)間點(diǎn)抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的外周血，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗得到BAL液。采用全血染色、BAL液細(xì)胞染色、分離PBL、ELISPOT、ICS等方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能進(jìn)行了分析。結(jié)果：HMBPP在IL-2同時(shí)存在的情況下，不僅可以在體外

5、刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Vγ2V82+T細(xì)胞增殖，而且在體內(nèi)同樣可以刺激Vγ2V82+T細(xì)胞的大幅度增殖，包括外周血和局部組織。同時(shí)抗原特異性Vγ2V82+T細(xì)胞也顯著增加，但抗原特異性CD4+及CD8+細(xì)胞則無(wú)明顯變化。結(jié)論：HMBPP+IL-2不僅在體外可特異性刺激Vγ2V82+T細(xì)胞的增殖活化，還可以在動(dòng)物體內(nèi)特異性刺激外周血及局部組織的Vγ2V62+T細(xì)胞數(shù)量激增、功能活化，因此使對(duì)機(jī)體Vγ2Vδ2+T細(xì)胞進(jìn)行人工調(diào)控成為可能。 第

6、三部分、分枝桿菌感染的免疫治療研究 目的：探討靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物分枝桿菌感染模型接受免疫治療的效果。方法：以靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物為模型，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：對(duì)照組、ostim組、IL-2組和Picostim+IL-2組。對(duì)所有動(dòng)物采用靜脈注射的方式感染BCG，然后根據(jù)分組對(duì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予Picostim和/或IL-2治療。在不同時(shí)間點(diǎn)抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的外周血，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗得到BAL液。采用全血染色、BAL液細(xì)胞染色、分離PBL、ELISP

7、OT、ICS及外周血BCG CFU計(jì)數(shù)等方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能進(jìn)行了全面分析，評(píng)價(jià)Picostim和/或IL-2的治療效果。結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在感染BCG并接受相應(yīng)治療后，其外周血和局部組織中的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量、亞群分布及功能反應(yīng)變化均不明顯。而Picostim+IL-2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血和局部組織中Vγ2V/52+T細(xì)胞數(shù)量在治療后第四天即出現(xiàn)明顯增加，并可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)六周以上。更為重

8、要的是，與對(duì)照組相比，Picostim+IL-2組Vγ2V62+T細(xì)胞EM亞群升高明顯，且出現(xiàn)時(shí)間早，于第四天即達(dá)高峰。而且其PBL經(jīng)HMBPP刺激后，分泌IFN-γ和Perforin的能力均大大加強(qiáng)，且高峰較對(duì)照組提前，而且外周血中BCG CFU計(jì)數(shù)也較其他組為低。結(jié)論P(yáng)icostim和IL-2同時(shí)給藥，無(wú)論對(duì)Vγ2Vδ2+T細(xì)胞的表型還是功能均產(chǎn)生了極其顯著的影響，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Vγ2Vδ2+T細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)強(qiáng)度增大，出現(xiàn)時(shí)間提前，且