SLAM在結(jié)核分枝桿菌感染過程中的作用及機(jī)制.pdf

1、結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是一種古老的嚴(yán)重影響人類健康的世界性傳染病。雖然在很大程度上是可以治愈的，但是近年來結(jié)核病有卷土重來的趨勢(shì)，根據(jù)WHO報(bào)道，盡管有各種各樣的應(yīng)對(duì)策略，但是僅2010年就新增結(jié)核病患者為900萬(wàn)，并且有140萬(wàn)人死于結(jié)核病。如今結(jié)核病再一次成為威脅人類健康的殺手，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌免疫機(jī)制的研究也成為各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。
　　結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tubercul

2、osis，M.tb）引起的，其中肺結(jié)核約占70％，其他有淋巴結(jié)結(jié)核、骨結(jié)核和腦膜結(jié)核等。在肺結(jié)核的感染過程中，肺泡巨噬細(xì)胞是控制結(jié)核分枝桿菌的主要效應(yīng)細(xì)胞之一。但是肺泡巨噬細(xì)胞是把“雙刃劍”，它既能夠殺傷一部分入侵的結(jié)核分枝桿菌，又能夠成為入侵的結(jié)核分枝桿菌的避難所。所以肺泡巨噬細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌的相互作用直接決定著結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后。因此巨噬細(xì)胞在結(jié)核病的研究中十分重要。
　　本研究主要從結(jié)核分枝桿菌對(duì)SLAM表達(dá)的調(diào)節(jié)

3、，SLAM對(duì)結(jié)核分枝桿菌識(shí)別及SLAM識(shí)別結(jié)核分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響以及SLAM在小鼠感染模型中的作用三個(gè)方面研究SLAM在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用。首先我們成功建立了結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞和小鼠的模型，證明結(jié)核分枝桿菌在感染巨噬細(xì)胞后可以上調(diào)SLAM的表達(dá)。然后，我們成功構(gòu)建了SLAM上調(diào)表達(dá)及下調(diào)表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過包裝慢病毒建立了穩(wěn)定上調(diào)和下調(diào)表達(dá)SLAM的RAW264.7巨噬細(xì)胞系，進(jìn)而證明SLAM的上調(diào)表達(dá)可以促

4、進(jìn)相關(guān)炎癥反應(yīng)，并且SLAM的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)可以影響巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷。但是SLAM不可以直接結(jié)合BCG，也不會(huì)在BCG感染后參與自噬小體的形成。我們通過聚乙烯亞胺包裹質(zhì)粒的方法在體內(nèi)對(duì)SLAM的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)干預(yù)，結(jié)果證明SLAM的表達(dá)可以促進(jìn)肺臟炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)肺部病理變化的程度，促進(jìn)肺部結(jié)核分枝桿菌的清除。從而為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，進(jìn)而為新型疫苗的研發(fā)和免疫治療方法的創(chuàng)新提供了新

5、的方向。
　　一、結(jié)核分枝桿菌對(duì)SLAM表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　1.結(jié)核分枝桿菌感染模型的建立
　　為了研究SLAM在結(jié)核分枝桿菌感染過程中的作用，根據(jù)文獻(xiàn)我們建立了結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠模型和細(xì)胞模型。每只C57BL/6J小鼠經(jīng)鼻腔滴入1×107CFU的BCG，4周后取樣檢測(cè)。病理切片和菌落形成單位（CFU）實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，正常小鼠肺臟經(jīng)過HE染色后可以看到肺泡壁很薄，沒有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血等癥狀，而結(jié)核分枝桿菌感染后的小鼠肺

6、臟可以明顯看到肺泡壁變厚，肺間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔有出血癥狀。另外感染后的小鼠肺臟中能檢出約105-106數(shù)量級(jí)的結(jié)核分枝桿菌，未感染小鼠的肺臟中則沒有該菌檢出。綜上結(jié)果說明小鼠感染模型建立成功。同時(shí)我們以（MOI10:1）的量用BCG感染RAW264.7細(xì)胞，6小時(shí)后檢測(cè)該細(xì)胞中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平，結(jié)果顯示BCG感染后各炎癥因子都有明顯上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，證明細(xì)胞感染模型的建立成功。
　　2.結(jié)核分枝桿菌的

7、感染可以上調(diào)SLAM的表達(dá)
　　在結(jié)核分枝桿菌感染模型建立后，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了小鼠肺臟巨噬細(xì)胞上SLAM的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在感染BCG后，小鼠肺臟巨噬細(xì)胞上SLAM會(huì)上調(diào)表達(dá)，SLAM陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞比例由感染前的12%左右上升到感染后的19%左右。RAW264.7細(xì)胞在感染BCG后，SLAM的表達(dá)也會(huì)上調(diào)。Real-time PCR結(jié)果顯示感染BCG后6h SLAM的mRNA水平上調(diào)80倍左右，流式結(jié)果顯示在BCG感染

8、24h后SLAM蛋白表達(dá)水平上調(diào)3倍左右。
　　二、SLAM對(duì)結(jié)核分枝桿菌的識(shí)別及對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響
　　1. SLAM基因的克隆及各真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　為了研究SLAM在結(jié)核分枝桿菌感染過程中的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)相關(guān)引物，構(gòu)建了SLAM的上調(diào)表達(dá)載體。首先我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性引物從小鼠脾臟總RNA中成功擴(kuò)增出SLAM基因，測(cè)序正確后將其插入到pcDNA3.1（-）和pDsRED-N1兩個(gè)真核表達(dá)載體中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)we

9、stern blot和免疫熒光檢測(cè)，pcDNA3.1-SLAM和pDsRED-N1-SLAM都能夠正常表達(dá)。
　　2.SLAM基因上調(diào)及下調(diào)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建、病毒包裝及相應(yīng)細(xì)胞株的建立
　　為了研究SLAM在結(jié)核分枝桿菌感染過程中的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了相關(guān)引物及shRNA，構(gòu)建了SLAM的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)慢病毒載體載體，并用包裝的病毒建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。首先我們根據(jù)shRNA原則設(shè)計(jì)了針對(duì)載體pLL3.7的shRNA，和針對(duì)

10、載體pMSCV的引物。經(jīng)測(cè)序鑒定pLL3.7-shRNA-SLAM和pMSCV-SLAM構(gòu)建成功。然后將構(gòu)建好的病毒包裝載體與各自對(duì)應(yīng)的輔助載體以一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集含病毒的細(xì)胞上清，感染RAW264.7細(xì)胞。感染后36h觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。然后流式細(xì)胞儀分選得到高純度的SLAM表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的RAW264.7細(xì)胞。
　　3.SLAM能增強(qiáng)BCG感染后巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)
　　在BCG感染SLAM上調(diào)或

11、下調(diào)RAW264.7細(xì)胞后，我們用Real-time PCR的方法檢測(cè)了細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6各炎癥因子的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在SLAM上調(diào)表達(dá)后，巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基礎(chǔ)表達(dá)都有所下降，其中IL-1β和IL-6下降約兩倍（P<0.05），TNF-α有下降趨勢(shì)。奇怪的是在BCG感染后，卻出現(xiàn)相反的現(xiàn)象，SLAM上調(diào)表達(dá)組的TNF-α和IL-1β表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。然而IL-

12、6的表達(dá)卻不同，與對(duì)照相比，在BCG感染后其表達(dá)沒有像TNF-α和IL-1β那樣上升，反而呈下降趨勢(shì)（P<0.05）。在下調(diào)SLAM的表達(dá)后，巨噬細(xì)胞內(nèi)促炎因子的基礎(chǔ)表達(dá)水平有上升趨勢(shì)。在SLAM下調(diào)表達(dá)后，巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基礎(chǔ)表達(dá)都有所上升，其中IL-1β和IL-6上升很明顯（P<0.05），TNF-α僅表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。有趣的是BCG感染后，與對(duì)照組相比SLAM下調(diào)組的TNF-α和IL-1β表達(dá)則顯著下降（

13、P<0.05）。IL-6的表達(dá)依然與眾不同，與對(duì)照相比，在BCG感染后其表達(dá)沒有像TNF-α和IL-1β那樣下降，反而呈上升趨勢(shì)（P<0.05）。
　　三、SLAM在小鼠感染模型中的作用
　　1.SLAM促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌感染后的炎癥反應(yīng)
　　為了研究小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后SLAM在體內(nèi)的功能，我們以PEI包裹質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法在小鼠體內(nèi)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)SLAM，滴鼻感染BCG，4周后取小鼠肺臟做病理切片，HE染色后鏡下觀

14、察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BCG感染后各組小鼠的肺臟都有病變及炎癥浸潤(rùn)。但是對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SLAM上調(diào)組小鼠的肺臟炎性浸潤(rùn)最嚴(yán)重，呈現(xiàn)實(shí)質(zhì)性病變，形成大量結(jié)節(jié)，其對(duì)照組的炎性浸潤(rùn)相對(duì)較輕，形成的實(shí)質(zhì)性結(jié)節(jié)也相對(duì)較??；SLAM下調(diào)組小鼠的肺臟炎性浸潤(rùn)最少，只有很小的實(shí)質(zhì)性結(jié)節(jié)形成，而其對(duì)照組病變則較為嚴(yán)重。通過肺損傷評(píng)分能很直觀的看出，SLAM上調(diào)可以促進(jìn)小鼠肺部炎癥的發(fā)生，SLAM下調(diào)可以抑制小鼠肺部炎癥的發(fā)生（P<0.05）。
　　2.SLA

15、M促進(jìn)小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除
　　結(jié)核分枝桿菌能逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷和清除，這是其難以防治的一個(gè)主要因素。為了研究SLAM在結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型中是否對(duì)該病菌的生存與繁殖產(chǎn)生影響，我們做了小鼠肺臟的病理切片，并且用抗酸染色法檢測(cè)肺臟中BCG的存在。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，SLAM上調(diào)表達(dá)小鼠的肺臟中呈紅色的BCG數(shù)目最少，這或許與其炎癥程度有關(guān)，較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了機(jī)體對(duì)BCG的殺傷與清除；SLAM下調(diào)組小鼠肺臟中的BCG最

16、多，與對(duì)照組小鼠相比，SLAM下調(diào)組小鼠的肺臟很多細(xì)胞中都有紅色BCG的存在。另外CFU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SLAM下調(diào)組結(jié)核分枝桿菌的CFU高于其他組，SLAM上調(diào)組結(jié)核分枝桿菌的CFU低于其對(duì)照組（P<0.05）。
　　3.SLAM對(duì)小鼠肺臟巨噬細(xì)胞炎癥因子的影響
　　在體外SLAM能在巨噬細(xì)胞上調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，并且在體內(nèi)SLAM也能影響結(jié)核分枝桿菌感染后小鼠肺臟的病理變化，那么SLAM能否在體內(nèi)影響小鼠肺臟巨噬細(xì)胞

17、炎癥因子的表達(dá)還不清楚。為此我們?cè)谏险{(diào)和下調(diào)表達(dá)SLAM的小鼠感染結(jié)核分枝桿菌4周后，取其肺臟制成單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀分析CD11b+F4/80+陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-10的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SLAM上調(diào)組小鼠TNF-α陽(yáng)性的肺臟巨噬細(xì)胞多于其對(duì)照組（P<0.05）；SLAM下調(diào)組小鼠TNF-α陽(yáng)性的肺臟巨噬細(xì)胞少于其對(duì)照組（P<0.05）。流式分析發(fā)現(xiàn)，SLAM下調(diào)組小鼠IL-10陽(yáng)性的肺臟巨噬細(xì)胞多于其對(duì)照組（P<