MicroRNA-146a在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前全球有近1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌。全球有活動性肺結(jié)核病人約2000萬，每年新發(fā)結(jié)核病人約800-1000萬，每年約有300萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。近年來，由于結(jié)核分枝桿菌耐多藥菌株的流行及艾滋病毒結(jié)核分枝桿菌合并感染等原因，結(jié)核病的防控形勢越加嚴(yán)峻，深入研究結(jié)核病的感染和發(fā)病機(jī)制顯得更為急迫。結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，其表面存有多種糖脂成分，可被巨噬細(xì)胞表面眾多

2、模式識別受體如補(bǔ)體受體、甘露糖受體、TLRs及NLRs識別進(jìn)入巨噬細(xì)胞。作為最主要的固有免疫細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞之一，巨噬細(xì)胞是宿主控制結(jié)核分枝桿菌感染播散的重要防御屏障。然而同時，巨噬細(xì)胞亦是結(jié)核分枝桿菌的宿主細(xì)胞，在結(jié)核感染、繁殖、擴(kuò)散過程中起到了關(guān)鍵的作用。結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后一方面可被細(xì)胞消化清除，另一方面可通過諸多逃逸機(jī)制避免機(jī)體的殺傷，并在細(xì)胞內(nèi)存活繁殖。感染導(dǎo)致的不同結(jié)局可能取決于細(xì)菌的毒力以及巨噬細(xì)胞本身的活化狀態(tài)。

3、因此，研究固有免疫中巨噬細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌的相互作用，對了解機(jī)體在感染早期對于結(jié)核分枝桿菌的清除十分重要。microRNA (miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的長度約為20～24 nt的非編碼單鏈小分子RNA，可與靶基因mRNA3'非編碼區(qū)(3'-untranslated region-UTR)結(jié)合，降解靶基因 mRNA 或抑制靶基因翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。自1993年被首次報道以來，已有上千條miRNA在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，但其中絕大部

4、分功能未明。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛參與到基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等多種生命過程中。近年來，關(guān)于miRNA在自身免疫性疾病及腫瘤研究中的報道屢見不鮮。然而，對于結(jié)核這樣一種古老而又嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病，miRNA在其中發(fā)揮的作用我們卻知之甚少。miR-146a是第一個被認(rèn)為對免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，其功能十分強(qiáng)大。大量研究顯示，miR-146a廣泛參與了多種炎癥及自身免疫性疾病等免疫反應(yīng)相關(guān)疾病

5、的發(fā)生過程。有研究報道m(xù)iR-146a基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān)，然而，關(guān)于miR-146a在結(jié)核分枝桿菌感染及結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的功能性研究尚無報道?；谝陨涎芯勘尘埃狙芯拷⒘朔€(wěn)定的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞模型，觀察結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細(xì)胞miR-146a的誘導(dǎo)表達(dá)以及巨噬細(xì)胞功能變化情況，分析miR-146a在其中發(fā)揮的作用及可能的機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。
　　第一部分 結(jié)

6、核分枝桿菌對miR-146a的表達(dá)調(diào)節(jié)
　　為了檢測結(jié)核分枝桿菌BCG感染是否會導(dǎo)致miR-146a表達(dá)水平發(fā)生變化，我們首先建立了結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠模型，并觀察了小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中miR-146a表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示，感染后3天miR-146a即表現(xiàn)出輕微的上調(diào)，隨著感染時間的延長miR-146a表達(dá)逐漸增高，至21天到達(dá)峰值，隨后出現(xiàn)下降。接下來，我們建立了結(jié)核分枝桿菌感染的體外模型，觀察了結(jié)核分枝桿菌BCG感染RAW

7、264.7細(xì)胞6h、12h、24h及36h時miR-146a的動態(tài)變化。實(shí)時定量PCR結(jié)果表明，感染后6hmiR-146a的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，至24h時到達(dá)頂峰，36h開始下降。此外，為證實(shí)miR-146a的誘導(dǎo)表達(dá)與BCG感染濃度密切相關(guān)，我們采用不同感染復(fù)數(shù)(MOI，即細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù))感染細(xì)胞，結(jié)果表明，miR-146a的誘導(dǎo)表達(dá)隨BCG感染復(fù)數(shù)的增加而增加。除RAW264.7細(xì)胞外，結(jié)核分枝桿菌感染還能誘導(dǎo)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞以及骨髓

8、來源巨噬細(xì)胞的miR-146a高表達(dá)。這些結(jié)果表明，在小鼠體內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌可在感染早期上調(diào)miR-146a的表達(dá)，體外細(xì)胞模型提示結(jié)核分枝桿菌感染能夠以時間依賴及劑量依賴的方式顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)。鑒于結(jié)核分枝桿菌胞壁含有有多種糖脂成分，這些成分也可能刺激巨噬細(xì)胞miR-146a上調(diào)表達(dá)，我們比較了活的結(jié)核分枝桿菌和熱滅活結(jié)核分枝桿菌作用于巨噬細(xì)胞對于miR-146a誘導(dǎo)表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，活菌與熱滅活菌均可誘導(dǎo)

9、miR-146a上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)幅度明顯不同，活菌誘導(dǎo)的miR-146a上調(diào)表達(dá)更加顯著。提示結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白等在miR-146a表達(dá)誘導(dǎo)中可能也起到了一定作用。接下來，我們觀察了參與miR-146a表達(dá)的信號通路，根據(jù)與結(jié)核分枝桿菌感染有密切關(guān)系的信號通路，我們采用相應(yīng)抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，感染后觀察miR-146a表達(dá)變化，結(jié)果顯示，僅NF-kB抑制劑組miR-146a表達(dá)明顯降低，提示結(jié)核分枝桿菌感染誘導(dǎo)的miR-146a上調(diào)表達(dá)

10、依賴于NF-κB信號通路。
　　第二部分 miR-146a在結(jié)核分枝桿菌感染中作用機(jī)制研究
　　通過第一部分的研究，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞miR-146a的表達(dá)。那么，究竟miR-146a在結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮了怎樣的作用？我們分別利用化學(xué)合成的miR-146a模擬物(miR-146a mimics)和miR-146a抑制劑(miR-146a inhibitor)過表達(dá)或下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)源性miR-146

11、a的水平，以結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后檢測炎性細(xì)胞因子及趨化因子的分泌情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-146a模擬物可顯著抑制巨噬細(xì)胞感染后TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平的表達(dá);與之相反，miR-146a抑制劑卻促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥應(yīng)答。以上結(jié)果提示:miR-146a可負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌BCG感染所產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答。巨噬細(xì)胞吞噬病原體后隨之活化，并可通過一氧化氮相關(guān)途徑

12、殺滅胞內(nèi)病原體，因此我們檢測了過表達(dá)和抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)源性miR-146a后一氧化氮的釋放情況以判斷巨噬細(xì)胞的殺菌功能。結(jié)果顯示，miR-146a模擬物可顯著降低巨噬細(xì)胞一氧化氮的釋放，而miR-146a抑制劑則可促進(jìn)一氧化氮的釋放。我們同樣分別將化學(xué)合成的miR-146a模擬物、抑制劑瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，48小時之后用FITC標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌BCG以20∶1的比例與巨噬細(xì)胞共孵育4h，以流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞對BCG的吞噬功

13、能。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-146a mimics的細(xì)胞，其吞噬結(jié)核分枝桿菌的百分比明顯增加，提示miR-146a促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對于結(jié)核分枝桿菌的吞噬。結(jié)核桿菌感染，特別是在感染早期，炎癥應(yīng)答對于結(jié)核分枝桿菌的清除十分重要。在明確了miR-146a可以負(fù)向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥應(yīng)答后，我們觀察了過表達(dá)或抑制內(nèi)源性miR-146a對結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖情況的影響。菌落計數(shù)結(jié)果顯示，相比較對照組，過表達(dá)miR-146

14、a后，結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖明顯增加。然而，miR-146a抑制劑僅顯示了輕微的抑制細(xì)菌復(fù)制的功能，與對照組相比并無統(tǒng)計學(xué)意義。推測可能與時間延長瞬時轉(zhuǎn)染的miR-146a抑制劑功能逐漸喪失有關(guān)。
　　第三部分 miR-146a靶向作用于IRAK-1和TRAF-6負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)
　　前已述及，miRNA通過與靶基因3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能，因此接下來這部分我們主要研究miR-146a是通過哪個或哪些靶基

15、因發(fā)揮作用的。我們通過TargetScan(http://www.targetscan.org)、PicTar(http://pictar-mdc-berlin.de)及Miranda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)等數(shù)據(jù)庫對miR-146a的靶基因進(jìn)行了分析和預(yù)測，并結(jié)合文獻(xiàn)報道確定了miR-146a的兩個可能靶基因 IRAK-1和TRAF-6作為進(jìn)一步研究的對象。生物信息學(xué)預(yù)測顯

16、示，IRAK-1和TRAF-6 3'-UTR含有與miR-146a互補(bǔ)的靶序列，因此我們構(gòu)建了含有IRAK-1和TRAF-6 3'-UTR結(jié)合序列的報告基因質(zhì)粒。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-146a可顯著抑制IRAK-1和TRAF-6 3'-UTR結(jié)合序列的報告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性。此外，通過熒光定量PCR和免疫印跡western blot的方法對過表達(dá)或抑制了miR-146a表達(dá)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行檢測，我們同樣發(fā)現(xiàn)IRAK-1和TR

17、AF-6的mRNA水平及蛋白水平均受到miR-146a的抑制。接下來，為了驗(yàn)證IRAK-1和TRAF-6在結(jié)核分枝桿菌感染誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中的作用，我們將特異性沉默IRAK-1和TRAF-6的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入巨噬細(xì)胞，以結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞24小時后檢測炎癥因子的分泌情況。結(jié)果顯示，相比對照組，si-IRAK-1和si-TRAF-6組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA水平和蛋白水平顯著降低，與過表達(dá)miR-146

18、a的結(jié)果相似。此外，敲除IRAK-1和TRAF-6之后，結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制明顯增加。然而，IRAK-1及TRAF-6對于巨噬細(xì)胞的吞噬并無明顯作用。由此，我們得出結(jié)論，miR-146a可通過抑制IRAK-1和TRAF-6發(fā)揮其負(fù)向炎癥調(diào)控作用。綜合以上研究，我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌BCG感染巨噬細(xì)胞后可顯著上調(diào)miR-146a的表達(dá);miR-146a在巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用，可減少促炎因