“雞尾酒”重組卡介苗的免疫原性和抗結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性.pdf

1、背景與目的:預(yù)防結(jié)核病的卡介苗（BCG）自發(fā)明以來在全球廣泛接種，能有效預(yù)防兒童重癥結(jié)核，但對(duì)成人肺結(jié)核保護(hù)性較差。BCG主要誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+Th1免疫應(yīng)答、且該應(yīng)答隨時(shí)間延長減弱，保護(hù)期僅10~15年；誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答較弱，不能阻止體內(nèi)潛伏感染細(xì)菌的再次激活。因此，在卡介苗已有的保護(hù)性和安全性優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，擬針對(duì)卡介苗的不足改造卡介苗，用于結(jié)核病的預(yù)防，具有重要意義和實(shí)踐價(jià)值。結(jié)合結(jié)核分枝桿菌在感染機(jī)體后存在的不同狀態(tài)且表達(dá)不同

2、的抗原譜和機(jī)體抗感染的免疫保護(hù)機(jī)制，本研究擬將前期構(gòu)建的、分別過表達(dá)結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢(shì)抗原Ag85A、Ag85B和HspX的三株增強(qiáng)型重組卡介苗，即rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X，按等比例混合，綜合利用其各自優(yōu)勢(shì)，制成“雞尾酒”重組卡介苗ABX。與親代卡介苗分別免疫小鼠，評(píng)價(jià)其抗結(jié)核分枝桿菌的短期保護(hù)效應(yīng)以及比較分析疫苗的免疫原性，為完成重組卡介苗 ABX菌株的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.評(píng)價(jià)重組

3、卡介苗ABX抗M.tb急性感染保護(hù)性：將rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X等比例配伍，制成重組卡介苗，命名為 ABX，作為實(shí)驗(yàn)組（1.02×106CFU/100μl/只）；親代BCG作為陽性對(duì)照組（1.5×106CFU/100μl/只），PBS免疫作為陰性對(duì)照組（100μl/只）。免疫C57BL/6小鼠8周后，尾靜脈注射M.tb H37Rv毒株(1.2×106CFU/只)攻擊感染。感染4周后，分別檢測(cè)小鼠肺臟和脾臟的

4、細(xì)菌載量以及病理改變，觀察存活率。
　　2.評(píng)價(jià)重組卡介苗ABX的細(xì)胞免疫應(yīng)答：同上免疫C57BL/6小鼠，免疫后12周和32周后，收集脾細(xì)胞。
　?。?）ELISA檢測(cè)抗原Ag85A、Ag85B和HspX特異性的TNF-α、IFN-γ、IL-2及IL-4水平，以PPD刺激為陽性對(duì)照，RPMI1640為陰性對(duì)照。
　?。?）流式細(xì)胞儀(FCM)結(jié)合胞內(nèi)因子染色法(ICS)分析抗原特異性的CD4+T細(xì)胞中分泌TNF-α+

5、、IFN-γ+、IL-2+細(xì)胞總數(shù)，進(jìn)一步分析單陽、雙陽和三陽性多功能CD4+T細(xì)胞。以PPD刺激為陽性對(duì)照，RPMI1640為陰性對(duì)照。
　?。?）CFSE標(biāo)記法檢測(cè)體內(nèi)Ag85B特異的CD8+T細(xì)胞的CTL殺傷活性。
　　3.評(píng)價(jià)重組卡介苗ABX的免疫記憶水平：利用流式細(xì)胞術(shù)，以CD62L、CD44表達(dá)作為分選標(biāo)志，分別檢測(cè)Ag85A、Ag85B和HspX抗原的CD4表位肽，Ag85B抗原CD8表位肽特異性的TCM（CD

6、62Lhi CD44hi）、TEM（CD62Llo CD44hi）水平；同時(shí)結(jié)合胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，進(jìn)一步分析 TEM細(xì)胞群中分泌IFN-γ和TCM細(xì)胞群中分泌IL-2的細(xì)胞數(shù)。
　　4.評(píng)價(jià)重組卡介苗ABX的體液免疫應(yīng)答：ELISA檢測(cè)小鼠血清中Ag85A、Ag85B和HspX特異性的抗體總IgG及亞類IgG1、IgG2a的水平。
　　結(jié)果:1.重組卡介苗ABX增強(qiáng)抗M.tb急性感染的保護(hù)性：與親代BCG免疫小鼠相比，ABX

7、組小鼠的肺臟荷菌量顯著降低（p=0.001），比BCG組減少0.585log；病理變化更輕微；肺臟切片偶見少量抗酸桿菌；短期存活率達(dá)100％。
　　2.重組卡介苗ABX誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答：
　?。?）免疫后12周和32周，與BCG組比較，ABX組產(chǎn)生較高水平的Ag85A、Ag85B和HspX特異性TNF-α、IFN-γ。在免疫后12周，ABX組產(chǎn)生Ag85B、HspX和PPD特異性IL-2水平高于BCG組（p<

8、0.05）。隨時(shí)間延長三種細(xì)胞因子分泌量增加?？乖禺愋缘腎L-4的濃度在各組間均低于30pg/mL，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）免疫后12周和32周，ABX疫苗組抗原特異性CD4+T細(xì)胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細(xì)胞總數(shù)比BCG組顯著增加，IL-2細(xì)胞總數(shù)隨免疫時(shí)間延長，顯著升高。進(jìn)一步分析多功能CD4+T細(xì)胞數(shù)量，ABX疫苗組誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+單陽細(xì)胞及TNF-α+-IFN-γ+雙陽

9、細(xì)胞最為顯著，均不同程度高于BCG組（p<0.05）。同時(shí)，Ag85A特異性的三陽，Ag85B特異性的IFN-γ+-IL-2+雙陽細(xì)胞也均顯著高于BCG組（p<0.05）。
　?。?）免疫后12周和32周，ABX組靶向Ag85B的特異性殺傷率分別為28.8％和30.7％，分別顯著高于BCG組的9.64％和8.47％（p<0.05）。
　　3.重組卡介苗ABX維持較高免疫記憶水平：Ag85A、Ag85B、HspX的CD4抗原肽

10、刺激，ABX組在免疫后12周和32周特異性TCM、TEM細(xì)胞數(shù)均高于BCG組，并且以TEM細(xì)胞為主（p<0.05）。Ag85B的CD8抗原肽刺激，ABX疫苗組以TCM細(xì)胞較多。分泌IL-2、IFN-γ的記憶細(xì)胞隨時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)增加。
　　4.重組卡介苗ABX誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體：與BCG免疫小鼠比較，ABX免疫小鼠32周產(chǎn)生較高水平Ag85A、Ag85B和HspX特異性抗體，尤其以IgG2a最顯著（p<0.05），且明顯高

11、于免疫后12周水平（p<0.05）。ABX疫苗組IgG2a:IgG1比值大于1，隨時(shí)間延長，更趨向于Th1型免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論:“雞尾酒”重組卡介苗ABX免疫對(duì)急性攻毒感染小鼠具有很強(qiáng)的免疫保護(hù)性，其保護(hù)性有賴于能誘導(dǎo)穩(wěn)定、持久的與過表達(dá)抗原相關(guān)的特異性CD4+Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要產(chǎn)生以TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+單陽細(xì)胞及TNF-α+-IFN-γ+雙陽為特征的CD4+多功能T細(xì)胞，并增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的特異性