重組卡介苗rBCG--XB的免疫原性和保護性.pdf

1、背景與目的:
　　卡介苗（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一被國際公認并廣泛使用的結核病預防疫苗。現(xiàn)已明確其可有效預防兒童重癥結核病，但對成人結核病預防效果差。然而，成人是結核病發(fā)病的主要人群。因此，在繼承卡介苗有效預防兒童結核病的基礎上，發(fā)展重組卡介苗以增強其預防成人結核病的能力，具有重要的科學意義和實踐價值?；诔扇私Y核病的發(fā)病機制以及卡介苗不能預防成人

2、結核病的潛在機制，本研究中，我們構建了一種新型的共表達Ag85B（原發(fā)感染階段結核分枝桿菌的分泌抗原）和HspX（潛伏感染階段結核分枝桿菌特征性表達抗原）抗原的重組卡介苗菌株，即rBCG::XB。免疫C57BL/6小鼠，比較rBCG::XB與rBCG::85B（表達Ag85B蛋白）、rBCG::X（表達HspX蛋白）和BCG抗結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染的保護效果及其免疫原性，為獲得

3、更為有效的卡介苗用于結核病的預防奠定基礎。
　　方法:
　　1.重組卡介苗 rBCG::XB菌株的構建：構建質粒pMXAg85B并將其電轉入BCG中國株而獲得重組卡介苗rBCG::XB，然后用逆轉錄熒光定量PCR（reverse transcription fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）方法檢測重組卡介苗中Ag85B和HspX的mRNA表達水平。
　　2.評價重組卡介苗rB

4、CG::XB抗M.tb感染保護性：將rBCG::XB與rBCG::85B、rBCG::X和 BCG分別免疫C57BL/6小鼠（1×106CFU/只），以PBS為陰性對照，BCG為陽性對照。免疫后第12周，用結核分枝桿菌H37Rv標準毒株經滴鼻方式感染小鼠，感染劑量為1×105CFU/只。分別在感染4、10和20周后（即三個時間點）處死小鼠，對小鼠的肺臟和脾臟進行菌落計數(shù)并評估其肺臟病理改變。
　　3.分析重組卡介苗rBCG::XB

5、的免疫原性：C57BL/6小鼠免疫12和32周后收集小鼠血清或脾細胞。
　?。?）ELISA方法檢測免疫小鼠脾細胞分泌抗原特異的Th1和Th2型細胞因子的水平。
　　（2）ELISA方法檢測免疫小鼠血清中抗原Ag85B和HspX特異的IgG及其亞類IgG1、IgG2a的水平。
　?。?）流式細胞術結合胞內細胞因子染色檢測抗原Ag85B、HspX和PPD刺激后抗原特異的多功能CD4+T細胞標志。
　?。?）流式細胞

6、術結合胞內細胞因子染色檢測脾細胞抗原特異的免疫記憶
　?。?）CFSE標記法分析Ag85B肽特異的CD8+T細胞的CTL活性
　　結果:
　　1.成功構建過表達Ag85B和HspX蛋白的重組卡介苗rBCG::XB菌株，并通過RT-PCR證實其高表達Ag85B和HspX蛋白。
　　2. rBCG::XB給予機體更強而持久的保護性。
　　3. rBCG::XB誘導產生抗原特異的Th1型免疫應答。
　　4.

7、 rBCG::XB誘導產生抗原特異的單或多功能CD4+T細胞。
　　5. rBCG::XB誘導產生更高水平的CD4+記憶性T細胞。
　　6. rBCG::XB誘導產生更強而持久的Ag85B抗原特異的CTL活性和更高水平的CD8+記憶性T細胞。
　　結論:
　　1.共表達Ag85B和HspX多階段抗原的rBCG::XB抗結核分枝桿菌感染的保護性強于BCG和僅表達單個抗原的重組卡介苗。
　　2.rBCG::XB