重組乙肝疫苗免疫原性、IgY制備及被動免疫機制研究.pdf

1、本研究采用電轉(zhuǎn)化方法分別將質(zhì)粒pcDNA3s與pEGFPC3轉(zhuǎn)化到減毒鼠傷寒沙門氏菌SL8786、SL8132，構(gòu)建成功重組減毒鼠傷寒沙門氏菌SL8786/pcDNA3s、SL8132/pcDNA3s、SL8786/EGFPC3；研究了外源質(zhì)粒pcDNA3s被重組減毒鼠傷寒沙門氏菌承載后在小鼠體內(nèi)的組織分布、代謝以及SL8786/pcDNA3s在動物體內(nèi)的細胞免疫與體液免疫應(yīng)答；檢測了增強型綠色熒光蛋白C3(EGFPC3)在小鼠與雛雞體

2、內(nèi)熒光表達；利用重組減毒鼠傷寒沙門氏菌乙肝疫苗與重組乙肝酵母疫苗制備了卵黃免疫球蛋白(Immunoglobulin Yolk，IgY)，進行了IgY的分離提純、理化性質(zhì)與重組減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的細胞免疫與體液免疫應(yīng)答研究。以基因芯片為技術(shù)平臺，研究了特異性IgY誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟基因的表達，為重組減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗與特異性IgY在動物疾病防治中的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。 應(yīng)用 SDS-PAPG 檢測到重

3、組減毒鼠傷寒沙門氏菌SL8786/pcDNA3s、SL8132/pcDNA3s中含有930bp大小的條帶，經(jīng)過基因序列分析，該重組菌含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列。在體外穩(wěn)定試驗中，重組減毒鼠傷寒沙門氏菌SL8786/EGFPC3經(jīng)LB固體及液體培養(yǎng)基連續(xù)傳15代后，單個菌落和菌液均呈綠色；減毒鼠傷寒沙門氏菌口服后，流式細胞儀檢測到EGFPC3在小鼠腹腔灌洗巨噬細胞中表達。在體內(nèi)穩(wěn)定試驗中，經(jīng)小鼠連續(xù)傳代10次，從肝臟、脾臟中分

4、離的細菌經(jīng)LB固體培養(yǎng)仍為綠色，證明構(gòu)建的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌是穩(wěn)定的。免疫后，在小鼠肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、十二指腸、肌肉等組織有熒光表達。表達EGFPC3的重組鼠傷寒沙門氏菌的成功構(gòu)建為減毒鼠傷寒沙門氏菌作為活載體的基因工程疫苗研制提供一個優(yōu)良模型。 減毒鼠傷寒沙門氏菌原菌SL8132、SL8786接種后連續(xù)觀察雛雞10天，不同劑量組的感染均未引起死亡，1日齡高劑量(10<'9> CFU/只)接種組對平均增重有明顯的抑制作

5、用(P<0.01)，其它免疫組的平均增重與對照組差異不顯著。接種后7周，肝臟、脾臟中已沒有菌落；糞便中僅有極少量的菌落，口服減毒鼠傷寒沙門氏菌在完成抗原呈遞后即被雞體免疫系統(tǒng)所清除，未發(fā)現(xiàn)口服疫苗菌的任何長期副作用。 將重組減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗SL8786/pcDNA3s，分別灌胃飼服小鼠，用流式細胞術(shù)檢測貼壁培養(yǎng)的小鼠脾細胞中SL8786/EGFPC3陽性率分別為19.20％和17.36％，而SL8786/pcDNA3口服的

6、小鼠脾細胞中EGFP陽性率分別僅為1.95％和1.63％；口服免疫SL8786/pcDNA3s誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強的特異性CTL應(yīng)答。首次免疫后第2、5、8、11周分別用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)測定血清中抗-HBs，口服免疫小鼠第11周的抗-HBs含量最高?？诜庖逽L8786/pcDNA3s口服轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠，抗-HBs含量在第12周達到高峰，而pcDNA3.0質(zhì)粒免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠，其血清中抗-HBs抗體始終為陰性。Tg小

7、鼠口服重組減毒鼠傷寒沙門氏菌免疫后第5周起至觀察結(jié)束(第12周)，未檢測到HBsAg和HBeAg；而pcDNA3.0免疫的Tg小鼠在此期間可檢測到HBsAg和HBeAg。 利用重組減毒鼠傷寒沙門氏菌與重組酵母乙肝疫苗免疫蛋雞，取免疫后45天的產(chǎn)蛋雞，頸動脈放血致死，無菌采取血清，分離卵巢上的各級卵泡，即原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、小生長卵泡、大生長卵泡、成熟卵泡，分別取卵黃，提取IgY并測定。重組沙門氏菌與酵母重組疫苗免疫得到

8、的IgY，隨免疫次數(shù)的增加，IgY抗體的含量增加，免疫后特異性抗體占總IgY的含量逐步升高。研究結(jié)果表明，IgY動態(tài)變化規(guī)律與血清抗體動態(tài)變化規(guī)律基本一致。隨著卵泡的生長，卵泡細胞分泌的液體聚集到卵泡，卵泡中IgY的含量隨卵泡發(fā)育階段逐級增加，說明隨卵泡的生長，血液中的血清抗體逐漸通過卵泡上的血管轉(zhuǎn)運到卵泡中。 應(yīng)用平板式膜超濾技術(shù)與DEAE離子交換層析法對卵黃免疫球蛋白(IgY)進行分離純化，確定分子截留量為100 kDa，操

9、作壓力差為0.12 MPa、進料溫度為30℃，pH 5.2，截留液抗體回收率達到91.89％，純度為86％；最后經(jīng)DEAE離子交換層析得到高純度的IgY。在小于75℃下抗HBV IgY有良好的熱穩(wěn)定性。對酸堿具有一定的耐受力，在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)，IgY活性相對穩(wěn)定。對胃蛋白酶具有良好的抵抗能力(pH>4)。對胰蛋白酶非常敏感，經(jīng)2h酶解處理，IgY的結(jié)合活性完全喪失。IgY具有很好的耐反復(fù)凍融的特性，即使經(jīng)過6次反復(fù)凍融，其

10、抗原結(jié)合活性相對穩(wěn)定。 采用基因芯片技術(shù)對轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟組織進行基因表達研究，特異性IgY免疫轉(zhuǎn)基因小鼠后，對其肝臟組織芯片雜交，雜交結(jié)果通過計算機掃描定量。結(jié)果顯示有4671條基因表達明顯，其中明顯差異表達的基因有110條，表達上調(diào)51條；顯著下調(diào)59條?；蛐酒Y(jié)果表明，大量與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因表達上調(diào)，上調(diào)基因主要是補體分子基因、細胞色素P450家族基因以及蛋白酶體基因、細胞凋亡基因等；下調(diào)基因主要是部分細胞色素P450家

11、族基因、與脂肪酸代謝有關(guān)的酶等?？挂腋翁禺愋訧gY誘導(dǎo)FAS下調(diào)，使B細胞減緩凋亡，誘導(dǎo)肝臟免疫應(yīng)答，一些免疫相關(guān)基因表達發(fā)生變化，如補體與酶的表達。特異性IgY抑制黃素單加氧酶(FMO)基因的表達；特異性IgY對小鼠肝細胞色素Cyp8b1、Cyp2f2、Cyp2d9、Cyp1a2、Cyp4a12、Cyp7b1有誘導(dǎo)作用，提示肝細胞色素P450含量增加，提高肝臟解毒能力；特異性IgY抑制小鼠肝細胞色素Cyp4a14、Cyp17a1、Cy