豬乙型腦炎病毒DNA疫苗載體的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、乙型腦炎(JE)是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的一種人畜共患蟲(chóng)媒性傳染病。豬是該病毒在自然界最重要的貯存和增殖宿主，免疫接種疫苗是有效防制該病傳播的重要方法。DNA疫苗是近年來(lái)JE預(yù)防的重要研究方向。本研究所構(gòu)建的DNA疫苗以JEV的prMΔE(prM基因以及編碼E蛋白的N端的398個(gè)氨基酸序列的基因，即prM-E基因去掉E基因的膜錨定蛋白序列)為靶基因，融入了組織纖溶酶原激活物(TPA)的分泌型信號(hào)序列(signal sequence

2、 derived from tissue plasminogen activator)修飾目的基因prMΔE，本研究還對(duì)此JEVDNA疫苗的免疫原性進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.PVAX-prMΔE和PVAX-TPA-prMΔE真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 采用RT-PCR擴(kuò)增SA14-14-2株prMΔE基因，將其插入pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒19T-PrMΔE。對(duì)19T-prMΔE的核苷酸序列測(cè)定與分析

3、表明：克隆的prMΔE基因長(zhǎng)度為1695bp，可編碼565個(gè)氨基酸殘基。采用重疊PCR的方法擴(kuò)增TPA信號(hào)肽序列，設(shè)計(jì)并合成兩條互補(bǔ)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，將其插入pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒19T-TPA。對(duì)19T-TPA的核苷酸序列測(cè)定與分析表明：克隆的TPA信號(hào)肽序列全長(zhǎng)69bp，可編碼23個(gè)氨基酸殘基。研究以PVAX1為載體，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒PVAX-prMΔE和PVAX-TPA-prMΔE。對(duì)所構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定

4、正確后，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的PVAX-TPA-prMΔE和PVAX-prMΔE真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，并以間接免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞外源基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光。表明上述構(gòu)建的兩種重組質(zhì)?？稍隗w外正確表達(dá)，且表達(dá)的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性，PVAX-TPA-prMΔE的蛋白表達(dá)量要明顯大于PVAX-prMΔE，說(shuō)明TPA信號(hào)肽序列有效促進(jìn)了目的蛋白的分泌表達(dá)。PVAX-TPA-prMΔE和

5、PVAX-prMΔE表達(dá)載體的成功構(gòu)建為JEVDNA疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.DNA疫苗(PVAX-TPA-prMΔE)的免疫原性研究
　　 分別將DNA疫苗PVAX-TPA-prMΔE、PVAX-prMΔE通過(guò)腿部肌肉注射6周齡昆明小鼠，間隔兩周加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。分別在首疫后的14、35與42d通過(guò)間接ELISA測(cè)定免疫小鼠血清特異性JEVIgG抗體水平。結(jié)果表明：各免疫組均可有效誘導(dǎo)特異性JEV

6、血清IgG抗體的產(chǎn)生，顯示了JEVDNA疫苗良好的免疫原性。同時(shí)，PVAX-TPA-prMΔE免疫組抗體水平在整個(gè)免疫過(guò)程中高于PVAX-prMΔE免疫組，在免疫后42天差異極顯著(P＜0.01)。MTT法檢測(cè)免疫小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，PVAX-TPA-prMΔE組小鼠特異性T淋巴細(xì)胞增殖SI值大大提高，出現(xiàn)可明顯促進(jìn)特異性淋巴細(xì)胞的增殖。因此將TPA信號(hào)肽序列融入質(zhì)粒中是提高DNA疫苗免疫活性的有效途徑。對(duì)三次加強(qiáng)免疫后