布魯氏菌新型疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、該研究所選的L7/L12核蛋白為公認(rèn)的T細(xì)胞保護(hù)性抗原,它具有高度的保守性,研究發(fā)現(xiàn),重組L7/L12蛋白能特異性地刺激感染動(dòng)物的單核細(xì)胞,并上調(diào)INF-γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而起到保護(hù)作用.以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組蛋白苗和DNA疫苗都表現(xiàn)了較好的免疫保護(hù)效果;而OMP16外膜脂蛋白存在于所有6種布魯氏菌中,也有一定的免疫保護(hù)作用;17.3kDa蛋白與布魯氏菌18kDa的外膜蛋白(優(yōu)秀的保護(hù)性抗原)的AA序列相似,因此,我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證17.

2、3kDa蛋白是否具有保護(hù)作用.對(duì)翻譯起始因子3蛋白進(jìn)行抗原預(yù)測(cè)表明其具有免疫原性.該課題以4種蛋白分子為研究對(duì)象,分別構(gòu)建了真核,原核表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)了這4種蛋白,免疫動(dòng)物后,研究其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答.從布魯氏菌中提取其全基因組DNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出4種蛋白的編碼基因,測(cè)序正確后分別克隆至原核表達(dá)載體PET32a(+)上,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出相應(yīng)的4種重組蛋白,WB鑒定后純化待用;同時(shí),4種編碼基因隆至真核表達(dá)載體PCDNA3

3、.1(+)上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后經(jīng)WB證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.將重組蛋白混合弗氏佐劑免疫動(dòng)物,同時(shí)DNA疫苗以PUMVC1-mGM-CSF重組質(zhì)粒為佐劑(各100μg/只)肌肉免疫動(dòng)物;每15d免疫一次,加強(qiáng)免疫三次后檢測(cè)免疫應(yīng)答指標(biāo),并進(jìn)行組間比較.ELISA法檢測(cè)到較高滴度的特異性抗體,WB也證實(shí)特異性抗體的產(chǎn)生;抗體亞型分類表明重組蛋白組的特異性IgG1/IgG2a大于1,而DNA疫苗免疫組卻小于1,說(shuō)明重組蛋白疫苗誘導(dǎo)

4、產(chǎn)生了Th2型為主免疫應(yīng)答,DNA疫苗產(chǎn)生了Th1型為主的免疫應(yīng)答.MTS法測(cè)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DNA組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)增強(qiáng),而重組蛋白組卻無(wú)顯著變化.進(jìn)一步通過(guò)ELISPOT方法檢測(cè)特異性活化的可分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù),DNA免疫組的斑點(diǎn)數(shù)顯著多于對(duì)照組(P<0.05);說(shuō)明誘導(dǎo)了特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答.流式細(xì)胞儀所得到的淋巴細(xì)胞亞群分類也得到了同樣的結(jié)果.本課題利用真核表達(dá)載體PCD

5、NA3.1成功構(gòu)建了含4種布魯氏菌編碼蛋白的重組質(zhì)粒,并利用原核表達(dá)載體表達(dá)了相應(yīng)的重組蛋白.通過(guò)ELISA、WB、ELISPOT及淋巴細(xì)胞亞群分類檢測(cè)疫苗在免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液及細(xì)胞免疫指標(biāo).該研究成功構(gòu)建了布魯氏菌基因工程疫苗,在國(guó)內(nèi)尚屬首次,利用流式細(xì)胞儀的分型技術(shù)和ELISPOT法評(píng)價(jià)布魯氏菌疫苗的細(xì)胞免疫指標(biāo)將促進(jìn)中國(guó)獸用疫苗及相關(guān)產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)方法的建立和發(fā)展,為他們的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).進(jìn)一步的攻毒實(shí)驗(yàn)尚在進(jìn)行中