新型流感病毒樣顆粒疫苗在老齡小鼠中免疫原性研究.pdf

1、目的：流感病毒是一類具有高度傳染性的呼吸道病毒，每年全球有25-50萬人因感染流感病毒致病或死亡。老齡人群由于免疫衰老對(duì)包括流感病毒在內(nèi)的傳染性疾病的發(fā)病率和死亡率均高于成年人。預(yù)防流感最有效的方法為疫苗接種，但研究表明傳統(tǒng)流感疫苗在老齡人口中的有效性只有不足50％，而在成年人中有效性可達(dá)90％。隨著世界人口老齡化日益嚴(yán)重，研發(fā)針對(duì)老齡人群安全有效的新型流感疫苗意義重大。為此，我們分別用整合免疫佐劑和改變免疫途徑兩種方法，探討流感病毒V

2、LPs在老齡小鼠中的免疫原性，希望為研發(fā)針對(duì)老齡人群的高效新型流感疫苗提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，從而啟示其他老年性疾病疫苗的開發(fā)和應(yīng)用。
　　方法：整合了免疫佐劑的新型流感病毒樣顆粒（Virus-likeparticles，VLPs）疫苗，通過不同免疫途徑，探討以H1N1流感病毒A/PertoRico/8/34（PR8）為基礎(chǔ)的VLPs在老齡小鼠中的免疫原性。（1）利用昆蟲重組桿狀病毒（Recombinantbaculovirus，rBVs

3、）表達(dá)系統(tǒng)，將整合有免疫佐劑－細(xì)菌鞭毛蛋白flagellin的PR8流感病毒血凝素蛋白HA及野生型流感病毒HA分別與神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)和基質(zhì)蛋白（Matrixproteins，M1）共表達(dá)，在體外組裝成新型流感病毒樣顆粒，分別命名為Flic-PR8VLPs和PR8VLPs。用電鏡觀察VLPs的形態(tài)，WesternBlot方法檢測flagellin、HA和M1的含量，血凝實(shí)驗(yàn)檢測HA活性，定量ELISA方法計(jì)算

4、每微克VLPs中的HA實(shí)際含量，并用制備的VLPs刺激骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，采用CytokineELISA方法測定VLPs體外生物學(xué)活性。（2）HA含量和活性相同的Flic-PR8VLPs和PR8VLPs分別通過肌肉注射免疫老齡小鼠和成年小鼠，初次免疫四周后加強(qiáng)免疫一次。每次免疫兩周后采用眶后靜脈叢刺破法采血，用ELISA方法鑒定血清中抗HA特異性抗體的產(chǎn)生，血凝抑制實(shí)驗(yàn)計(jì)算抗體滴度。加強(qiáng)免疫四周后，用致死量的同源鼠適應(yīng)流感病毒A/PR

5、/8/34，或者異源鼠適應(yīng)流感病毒A/California/04/2009進(jìn)行攻毒。攻毒后每天固定時(shí)間對(duì)小鼠稱重并觀察發(fā)病情況，攻毒后15天對(duì)小鼠采取安樂處死，取脾臟淋巴細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT檢測特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。（3）2μgPR8VLPs分別通過肌肉注射（IM）和皮內(nèi)注射（ID）兩種途徑免疫老齡小鼠和成年小鼠，免疫過程如前，用ELISA方法鑒定血清中抗HA特異性抗體的產(chǎn)生，血凝抑制實(shí)驗(yàn)計(jì)算抗體滴度。加強(qiáng)免疫四周后，用致死量的同源

6、鼠適應(yīng)流感病毒A/PR/8/34，或者異源鼠適應(yīng)流感病毒A/California/04/2009進(jìn)行攻毒。攻毒后每天固定時(shí)間對(duì)小鼠稱重并觀察發(fā)病情況，攻毒后15天對(duì)小鼠采取安樂處死，取脾臟淋巴細(xì)胞，ELISPOT檢測特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　結(jié)果：（1）VLPs特性檢測結(jié)果：經(jīng)純化的Flic-PR8VLPs和PR8VLPs均保持了與流感病毒粒子相似的形態(tài)及大小，說明整合flagellin并不影響VLPs的正常結(jié)構(gòu)。Western

7、Blot與血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)lic-PR8VLPs和PR8VLPs中HA含量相同且具有正常的生物學(xué)活性；定量ELISA顯示，每微克Flic-PR8VLPs和PR8VLPs均含有約6.8納克HA蛋白；CytokineELISA表明，無論在成年小鼠還是老齡小鼠中Flic-PR8VLPs和PR8VLPs均能刺激樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α，但是Flic-PR8VLPs刺激TNF-α產(chǎn)生的能力更強(qiáng)，并且增加Flic-PR8VLPs刺激濃度

8、對(duì)TNF-α產(chǎn)生影響不大，充分說明了flagellin作為免疫佐劑在其中發(fā)揮了重要免疫增強(qiáng)作用。（2）VLPs免疫小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)檢測結(jié)果：分別用Flic-PR8VLPs和PR8VLPs經(jīng)肌肉注射途徑免疫小鼠，成年小鼠組體內(nèi)產(chǎn)生的血清特異性抗體水平顯著高于老齡小鼠組。然而在老齡小鼠組內(nèi)，經(jīng)加強(qiáng)免疫后Flic-PR8VLPs與PR8VLPs相比，前者能誘導(dǎo)更高水平的IgG，且以IgG2a亞型為主。血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血清HI滴度在F

9、lic-PR8VLPs免疫的老齡小鼠組達(dá)到了214，而PR8VLPs免疫的老齡小鼠組其滴度只有128，前者為后者的1.7倍，該結(jié)果與ELISA結(jié)果相符，說明Flic-PR8VLPs能誘導(dǎo)更高效的抗HA抗體。（3）病毒攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用致死劑量同源鼠適應(yīng)A/PR/8/34流感病毒攻擊時(shí)，雖然PR8VLPs和Flic-PR8VLPs均能夠?qū)Ρ幻庖呃淆g小鼠提供一定的保護(hù)作用，但對(duì)老齡小鼠的保護(hù)效果明顯劣于成年小鼠組，體現(xiàn)在老齡小鼠體重下降程度較

10、大，然而用致死劑量異源鼠適應(yīng)A/California/04/2009流感病毒攻擊時(shí)，只有Flic-PR8VLPs能夠?qū)Ρ幻庖咝∈筇峁┍Ｗo(hù)作用，而PR8VLPs免疫的小鼠全部死亡，充分說明Flic-PR8VLPs具有更好的免疫原性。（4）不同免疫途徑免疫應(yīng)答反應(yīng)結(jié)果：PR8VLPs經(jīng)IM和ID途徑分別免疫小鼠后，IM組中成年小鼠組HA特異性IgG抗體水平略高于ID組，與之相反的是，在老齡小鼠組，雖然經(jīng)IM與ID免疫所產(chǎn)生的抗體水平均較成年

11、小鼠組低15倍之多，但是ID組產(chǎn)生的IgG抗體水平約為IM組的1.5倍。進(jìn)一步應(yīng)用ELISA方法對(duì)IgG亞型抗體分析表明，在老齡小鼠中，經(jīng)ID途徑免疫能夠誘發(fā)更高水平的抗原特異性IgG1產(chǎn)生，說明ID途徑免疫能夠通過Th2型免疫反應(yīng)提高流感病毒VLPs在老齡小鼠中的免疫原性。與ELISA結(jié)果相符，經(jīng)ID免疫的老齡小鼠組HI滴度達(dá)到了288，而IM免疫的老齡小鼠組HI滴度只有100，前者為后者的2.8倍左右，表明ID途徑免疫能誘導(dǎo)高效價(jià)的

12、抗HA抗體產(chǎn)生。（5）不同免疫途徑條件下病毒攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ID途徑免疫可提高對(duì)老齡小鼠免疫原性，主要表現(xiàn)在用致死劑量同源鼠適應(yīng)A/PR/8/34流感病毒攻擊時(shí)，IM與ID均能夠?qū)Ρ幻庖呃淆g小鼠提供一定程度保護(hù)作用，但對(duì)老齡小鼠的保護(hù)效果明顯劣于成年小鼠組，表現(xiàn)在老年小鼠體重下降程度較大。但是用致死劑量異源鼠適應(yīng)性A/California/04/2009流感病毒攻擊，只有ID途徑免疫PR8VLPs能夠?qū)Ρ幻庖呃淆g小鼠提供保護(hù)，而IM途徑免

13、疫PR8VLPsI的老齡小鼠全部死亡。
　　結(jié)論：（1）成功制備了整合免疫佐劑的流感病毒Flic-PR8VLPs和野生型流感病毒PR8VLPs，兩種流感病毒樣顆粒的HA含量相同。（2）Flic-PR8VLPs和PR8VLPs肌肉注射免疫成年和老齡小鼠，F(xiàn)lic-PR8VLPs顯示較強(qiáng)的免疫原性。（3）肌肉注射和皮內(nèi)注射兩種途徑免疫成年和老齡小鼠，成年小鼠組中兩種免疫途徑免疫原性未見顯著差異，老齡小鼠組中皮內(nèi)注射免疫途徑的免疫原性明