分子佐劑C3d增強(qiáng)豬流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的研究.pdf

1、豬流感(SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性高度傳染性呼吸道疾病。目前，包括H1N1、H3N2和H1N2亞型在內(nèi)的SI已成為危害許多國家豬群的疾病。而且，豬是禽、豬、人流感病毒的易感宿主，可最大限度地彼人等其他動(dòng)物流感病毒和禽流感病毒所感染，成為流感病毒基因重組或重配的“混合器”，是流感病毒新流行毒株產(chǎn)生的“孵育器”。因此，豬流感的控制不僅有經(jīng)濟(jì)上的意義，更有其深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生學(xué)意義。目前，廣泛應(yīng)用于臨床的是單價(jià)或多價(jià)的豬流感病毒

2、滅活疫苗。但豬流感病毒在雞胚中連續(xù)傳代有可能影響病毒的免疫原性。而且其免疫劑量大，同時(shí)還必須使用佐劑，從而增加了滅活疫苗的成本。因此，研制新一代疫苗以替代或作為滅活疫苗的有益補(bǔ)充就顯得尤其必要。另外，豬流感疫苗的研究應(yīng)該盡可能兼顧目前主要流行的幾種亞型。DNA疫苗因?yàn)槟軌蛲瑫r(shí)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答而受到青睞?；谪i流感病毒血凝素HA的DNA疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的效果。但由于DNA疫苗蛋白表達(dá)量低，激發(fā)的免疫應(yīng)答較弱，從而限制

3、了它的應(yīng)用。因此，提高DNA疫苗的免疫效果已成為基因免疫研究的熱點(diǎn)。一系列的研究表明，多拷貝的C3d分子與靶抗原偶聯(lián)極大地提高了特異抗原的免疫應(yīng)答水平。另外，用DNA疫苗免疫后再用重組病毒加強(qiáng)免疫的prime-boost免疫策略也顯示了很好的免疫效果。本研究探討了上述兩種策略在豬流感疫苗上的應(yīng)用效果。 為了探討分子佐劑C3d對豬流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的影響，本研究構(gòu)建了四種表達(dá)不同形式HA的質(zhì)粒DNA，分別為：表達(dá)分泌

4、型HA的質(zhì)粒pCA-sHA，表達(dá)全長HA的質(zhì)粒pCA-tmHA和融合表達(dá)三拷貝C3d(鼠源和豬源)與HA的質(zhì)粒pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3。四種質(zhì)粒與空載體pCAGGS分別免疫BALB/c小鼠后，分別用ELISA、HI試驗(yàn)和中和試驗(yàn)檢測抗HA抗體水平，并用硫氰酸鹽洗脫法檢測抗體親和力水平。結(jié)果顯示，免疫后第8周，pCA-sHA組與pCA-tmHA組的抗體水平?jīng)]有明顯差別，而pCA-sHA/mC3d3和pCA-s

5、HA/sC3d3免疫組的抗體水平顯著高于這兩組，并具有更強(qiáng)的抗體親和力。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)及細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫后第8周，pCA-tmHA誘導(dǎo)了更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和更高水平的IFN-γ，而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3誘導(dǎo)了更高水平的IL-4，結(jié)果說明，HA表達(dá)形式的變化影響了免疫反應(yīng)的類型，C3d與HA融合后通過誘導(dǎo)IL-4的產(chǎn)生而使免疫反應(yīng)傾向于Th2型。在隨后的同型或異型病毒攻擊試驗(yàn)中，通過對攻

6、擊病毒的分離、攻擊病毒在免疫小鼠體內(nèi)的分布情況以及攻毒后的免疫小鼠的病理變化的檢測，證實(shí)四種質(zhì)粒DNA都在不同程度上加速了同型攻擊病毒的清除，對免疫小鼠產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3免疫的小鼠對異型毒的攻擊也產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。結(jié)果表明，三拷貝分子佐劑C3d與分泌型HA融合后顯著提高了DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平，加速了抗體親和力成熟，并可以部分抵抗異型病毒的攻擊。另外，結(jié)果也表明，豬源補(bǔ)體

7、C3d可以用小鼠做模型來評價(jià)其分子佐劑的效力。 為了評價(jià)用DNA疫苗和重組病毒聯(lián)合免疫的效果，隨后進(jìn)行了第二次免疫攻毒試驗(yàn)。1-4組與5-8組分別免疫質(zhì)粒pCA-sHA、pCA-tmHA、pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3，初次免疫后，間隔4周，1-4組再用同一種質(zhì)粒加強(qiáng)免疫一次，5-8組用表達(dá)H3N2亞型豬流感病毒HA的重組偽狂犬病毒rPRV-HA加強(qiáng)免疫一次；第9組初次免疫用pCAGGS空載體，4周后用r

8、PRV-HA加強(qiáng)免疫：第10組免疫PRVBartha-K61疫苗株；第11組為不免疫不攻毒組對照。血清學(xué)分析結(jié)果顯示，對于rPRV-HA加強(qiáng)免疫組，在有DNA疫苗作基礎(chǔ)免疫的組，抗體水平高于rPRV-HA單獨(dú)免疫組。用DNA疫苗加強(qiáng)免疫與用rPRV-HA加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的抗體水平?jīng)]有明顯差別。但質(zhì)粒pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3做基礎(chǔ)免疫組的抗體水平要顯著高于質(zhì)粒pCA-sHA、pCA-tmHA做基礎(chǔ)免疫的組。這表明

9、，與C3d共表達(dá)的融合形式HA不但增強(qiáng)了抗體應(yīng)答，而且引發(fā)了良好的抗體免疫記憶，因此，在用rPRV-HA加強(qiáng)免疫后，抗體水平迅速上升，在加強(qiáng)免疫后第4周抗體水平顯著高于其他組。細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA疫苗與rPRV-HA聯(lián)合免疫組的IL-4和IFN-γ的水平顯著高于rPRV-HA單獨(dú)免疫組。并且，用rPRV-HA加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的IL-4和IFN-γ的水平高于用同種DNA疫苗加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平。結(jié)果表明，用rPRV-HA加強(qiáng)

10、免疫普遍增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。在隨后的同型豬流感病毒的攻擊試驗(yàn)中，各免疫組都在不同程度上加速了同型攻擊病毒的清除，對免疫小鼠產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。其中，用質(zhì)粒DNA免疫后再用rPRV-HA加強(qiáng)免疫產(chǎn)生了最好的保護(hù)作用。 本研究構(gòu)建的融合表達(dá)3拷貝C3d與HA的質(zhì)粒DNA可能作為豬流感的候選疫苗，為預(yù)防多種亞型豬流感疫苗的研究探索了新的思路。另外，用質(zhì)粒DNA做基礎(chǔ)免疫再用rPRV-HA加強(qiáng)免疫的免疫策略，也為豬流感疫苗的研究提供了新的