鴨病毒性肝炎C3d新型分子佐劑基因疫苗的研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文鴨病毒性肝炎C3d新型分子佐劑基因疫苗的研究姓名：裴宗飛申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：牛鐘相20090614鴨病毒性肝炎C 3 d 新型分子佐劑基因疫苗的研究試驗(yàn)二D H V V P I 基因的克隆和原核表達(dá)收集S P F 雞胚D H V 尿囊液，采用液氮研磨法提取病毒總R N A ， 針對G e n B a n k 已登錄的D H V - V P l 基因序列，自行設(shè)計(jì)一對引物，R T - P C

2、 R擴(kuò)增D H V V P l 基因，克隆到p M D l 8 ．T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L 2 1 ，篩選陽性克隆經(jīng)P C R 、酶切鑒定無誤后將其克隆到表達(dá)載體P G E X ．6 P —l ，P C R結(jié)果顯示，在7 1 4 b p 處有一明亮條帶，與預(yù)期大小一致；酶切產(chǎn)物凝膠電泳后出現(xiàn)了4 ．9k b 和7 ．1 k b 左右的載體片段條帶和插入目的片段條帶，證明與載體連接成功。轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)S D S ．P A G

3、 E 分析證明目的蛋白得到表達(dá)，W e s t e r n ．b l o t t i n g 證實(shí)表達(dá)的目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。試驗(yàn)三V P l 。C 3 d ．p e D N A 3 ．1 基因疫苗的構(gòu)建及免疫效果的研究重新設(shè)計(jì)一對引物，將鴨C 3 d 基因克隆到真核表達(dá)載體p c D N A 3 ．1 ( + ) ，構(gòu)建完成包含分子佐劑C 3 d 的真核表達(dá)載體C 3 d ．p c D N A 3 ．1 ；設(shè)計(jì)另一對引物，將D

4、H V V P l 段基因亞克隆至含分泌表達(dá)信號肽( t P A ) 序列的重組表達(dá)載體C 3 d ．p c D N A 3 ．1 ，克隆位置是C M V 啟動(dòng)子下游與C 3 d 序列上游的中間，構(gòu)建完成鴨病毒性肝炎( t P A ) ．V P l ．C 3 d ．p c D N A 3 ．1 基因疫苗；用該疫苗對小白鼠進(jìn)行免疫注射，通過檢測抗體效價(jià)等指標(biāo)，評價(jià)該疫苗的免疫保護(hù)效果。建立了檢測抗D H V 抗體的間接E L I S A

5、方法，并對該方法的各種反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化；以優(yōu)化的間接E L I S A 方法對小鼠血清抗體效價(jià)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示V P l ．C 3 d 。p c D N A 3 ．1 基因疫苗組抗體效價(jià)平均值為6 ．2 顯著高于未添加分子佐劑基因疫苗組的2 ．4 ；病毒中和試驗(yàn)表明該基因疫苗對D H V 病毒半數(shù)致死量的1 0 倍量及1 0 0 倍量攻擊保護(hù)率為1 0 0 ％。關(guān)鍵詞：V P l 基因；鴨C 3 d ； 基因疫苗： R T - R