補(bǔ)體C3d增強(qiáng)偽狂犬病毒gC基因免疫原性的研究.pdf

1、偽狂犬病（Pseudorabies）是當(dāng)今危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一，免疫接種仍是目前控制和預(yù)防該病的主要手段。傳統(tǒng)的豬偽狂犬病疫苗對控制疾病的發(fā)生和流行發(fā)揮了巨大作用，但存在毒力返強(qiáng)的安全隱患或免疫效果不佳等缺陷。研制更安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗一直是偽狂犬病研究的重要方向。 近年來偽狂犬病DNA疫苗研究很多，尤其是偽狂犬病毒的囊膜蛋白gB、gC和gD為主要抗原基因的核酸疫苗報(bào)答較多。偽狂犬病毒的囊膜蛋白gB、gC和gD是病

2、毒感染細(xì)胞的幾個(gè)關(guān)鍵步驟中所必需的基因。正是因?yàn)槿绱艘詡慰袢《镜哪夷さ鞍譯B、gC和gD為靶抗原的核酸疫苗首免后能夠比傳統(tǒng)疫苗更有效的減少宿主感染病毒后的排放，尤其宿主在有母源抗體存在的情況下應(yīng)用核酸疫苗能夠更好的起到更好的免疫保護(hù)作用。然而核酸疫苗的最大缺陷是產(chǎn)生的抗體水平低和較慢，目前報(bào)道的可以增強(qiáng)偽狂犬病毒核酸疫苗的方法中有應(yīng)用辛巴病毒作為載體，GM-CSF因子作為佐劑，CpG修飾，IL-2，IFN-γ等佐劑。然而盡管核酸疫苗盡

3、管可以誘導(dǎo)產(chǎn)生比較不錯(cuò)的細(xì)胞免疫水平但是其產(chǎn)生的中和抗體水平相對于滅活和弱毒疫苗過低。補(bǔ)體C3d能夠與靶抗原結(jié)合并有效增強(qiáng)抗原的體液免疫反應(yīng)，C3d作為補(bǔ)體被抗原激活后的最后裂解產(chǎn)物與抗原融合表達(dá)后可以顯著增強(qiáng)融合蛋白的免疫原性。 鑒于上述研究背景，本研究探討了補(bǔ)體C3d和補(bǔ)體C3d的受體結(jié)合功能區(qū)M28作為分子佐劑對偽狂犬病毒最主要的保護(hù)性抗原基因gC基因的免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)研究了豬源補(bǔ)體C3d與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)的核

4、酸疫苗的免疫效果。主要研究內(nèi)容如下： 1．豬、鼠、羊補(bǔ)體C3d基因的克隆與序列分析 從豬、鼠、羊肝臟細(xì)胞提取總RNA，通過RT—PCR擴(kuò)增出豬、鼠、羊補(bǔ)體C3d基因，并進(jìn)行了序列測定、糖基化位點(diǎn)進(jìn)化系統(tǒng)分析與序列比較，發(fā)現(xiàn)鼠源補(bǔ)體C3d基因全長897bp編碼299個(gè)氨基酸，與人補(bǔ)體C3d核苷酸序列同源性為83％，牛與羊的C3d基因的同源性達(dá)到了94％，豬與羊、牛、人的C3d的同源性差不多都在80％左右。 2．補(bǔ)體

5、C3d與gC基因融合表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá) 以pcDNA3.1+載體作為骨干，分別構(gòu)建了分泌型表達(dá)的gC基因的常規(guī)DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒sgC和多拷貝的鼠源補(bǔ)體C3d分子和M28與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)的DNA疫苗sgC-C3d<,3>、sgC-M28<,4>，同時(shí)構(gòu)建了豬源補(bǔ)體C3d分子與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)的DNA疫苗sgC-sC3d<,3>。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，Western blot檢測證實(shí)兩種表達(dá)

6、質(zhì)粒均能分泌表達(dá)gC重組蛋白。 3．補(bǔ)體C3d或M28與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)的DNA疫苗的免疫保護(hù) 將重組表達(dá)質(zhì)粒以100μg／只免疫BALB／c小鼠，三免后2周采用0.1ml×10<'5>TCID<,50>的PrV Ea株強(qiáng)毒攻擊。連續(xù)觀察兩周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sgC-C3d<,3>、sgC-sC3d<,3>、sgC-M28<,4>免疫組和sgC免疫組的保護(hù)率分別為100％、100％、88％和25％。說明多拷貝的補(bǔ)體C3

7、d或M28與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)的DNA疫苗sgC-C3d<,3>、sgC-sC3d<,3>、sgC-M28<,4>能提供更好的免疫保護(hù)。 4．補(bǔ)體C3d或M28與gc基因融合表達(dá)核酸疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng) 將構(gòu)建的核酸疫苗免疫BALB／c小鼠（100μg／只），免疫三次每次間隔三周。免疫后每兩周采集一次血，分離血清檢測ELISA抗體和中和抗體。結(jié)果顯示sgC-C3d<,3>或sgC-M28<,4>免疫組產(chǎn)生的抗體

8、滴度顯著高于sgC免疫組（P<0.01），而sgC-M284免疫組產(chǎn)生的抗體水平顯著低于sgC-C3d<,3>免疫組的抗體水平。豬源補(bǔ)體C3d與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)的DNA疫苗sgC-sC3d<,3>免疫組產(chǎn)生的抗體滴度也顯著高于sgC免疫組（P<0.01）。細(xì)胞因子檢測試驗(yàn)表明sgC-C3d<,3>、sgC-sC3d<,3>和sgC-M28<,4>免疫組產(chǎn)生的IL-4水平顯著高于sgC免疫組（P<0.01）。sgC，sgC-C3

9、d<,3>，sgC-M28<,4>和滅活疫苗組的中和抗體滴度在第八周分別達(dá)到了1：28，1：171，1：72和1：223。sgC免疫組的中和抗體水平在首免以及加強(qiáng)免疫后不同時(shí)間所產(chǎn)生的中和抗體均低于sgC-C3d<,3>、sgC-M28<,4>免疫組（P<0.01）。上述試驗(yàn)檢測結(jié)果說明補(bǔ)體C3d或M28與偽狂犬病毒gC基因融合表達(dá)能夠顯著的增強(qiáng)單獨(dú)表達(dá)gC基因的核酸疫苗的體液免疫反應(yīng)。 5．補(bǔ)體C3d或M28與gC基因融合表達(dá)

10、核酸疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng) 三免后2周每組取2只免疫小鼠進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分析疫苗產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示sgC、sgC-C3d<,3>免疫組的刺激指數(shù)（SI）明顯高于空白載體免疫組和滅活疫苗免疫組的SI（P（0.01）。sgC-sC3d<,3>和sgC-M28<,4>免疫組的刺激指數(shù)（SI）低于sgC、sgC-C3d<,3>免疫組產(chǎn)生的刺激指數(shù)（SI）。sgC-C3d<,3>免疫組的刺激指數(shù)（SI）最高并且略高于sgC免

11、疫組（P>0.05）。滅活疫苗免疫組和空載體免疫組的刺激指數(shù)（SI）最低，并且兩組的刺激指數(shù)（SI）差異不顯著（P>0.05）。細(xì)胞因子檢測試驗(yàn)表明sgC、sgC-mM28<,4>、sgC-sC3d<,3>、sgC-C3d<,3>四組IFN-γ的產(chǎn)生都比較相似（697pg／ml），而滅活疫苗免疫組的IFN-γ含量很低（239 pg／ml）（P<0.01）。 綜上所述，我們的研究證實(shí)了補(bǔ)體C3d與gC基因融合可以顯著的增強(qiáng)gC基因