狐、貉、貂源偽狂犬病毒分離鑒定及gC基因表達(dá).pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的一種多種動(dòng)物共患的烈性傳染病。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢、呼吸困難、母畜不孕、流產(chǎn)、死胎等。自2011年末疑似PR在我國(guó)遼寧、河北、山東等地的毛皮動(dòng)物中大量出現(xiàn)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了探尋病原學(xué)依據(jù)，從患病狐、貉、貂腦組織病料中分離到Fox1、Rac1、Mink1等多株P(guān)RV，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

2、　　發(fā)現(xiàn)分離毒株接種MDCK細(xì)胞均呈現(xiàn)出皰疹病毒特征的細(xì)胞病變。通過(guò)電鏡，可觀察到100～180nm帶有囊膜的病毒粒子。攻毒家兔和小白鼠均表現(xiàn)出典型的PR癥狀，并從腦組織中再次檢測(cè)到PRV gB基因，證明分離病毒為PRV。進(jìn)一步對(duì)Fox1、Rac1和Mink1株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在MDCK細(xì)胞上的TCID50可達(dá)10-7.83/mL～10-7.5/mL，對(duì)氯仿和胰酶敏感，在pH5～pH9的環(huán)境中穩(wěn)定，對(duì)熱具有較強(qiáng)的耐受性。測(cè)定

3、Rac1對(duì)小鼠的LD50為10-4.8/mL。
　　通過(guò)分子流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)獲得的狐、貉、貂源毒株與CLW2014-1株、TJ株、ZJ01株等近年來(lái)分離的豬源變異強(qiáng)毒株親緣關(guān)系最近。并且在Rac1株gE蛋白48位、497位和gC蛋白63～69位，觀察到了變異毒株特有的3處標(biāo)志性插入。表明造成此次狐、貉、貂PR流行的毒株并非疫苗株或國(guó)內(nèi)早期流行毒株，而極有可能是近年來(lái)新出現(xiàn)的PRV變異株，這為我國(guó)狐、貉、貂PR的防控提供了參考

4、和依據(jù)。
　　設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增PRV Rac1株gC基因膜外區(qū)，克隆至原核表達(dá)載體pET-32a的T7啟動(dòng)子下游和pGEX-6p-1的Tac啟動(dòng)子下游，構(gòu)建gC-His和gC-Gst重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Westernblot鑒定成功獲得目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物分子量大小分別為70kDa和76kDa。表明成功表達(dá)gC膜外區(qū)蛋白，為進(jìn)一步的免疫學(xué)研究，新型診斷和治療方法的建立奠定了基礎(chǔ)。