分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑應用于耐藥結核病治療的探索性研究.pdf

1、目的：
　　結核病嚴重危害人類健康，耐藥結核防治形勢尤為嚴峻。分枝桿菌噬菌體能裂解結核分枝桿菌，具有潛在藥用價值。本研究旨在通過對分枝桿菌噬菌體生物學特性、基因組學和血清學的研究篩選分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑的配方噬菌體。體外觀察噬菌體雞尾酒制劑殺滅結核分枝桿菌的能力以及恥垢分枝桿菌對雞尾酒制劑的耐藥突變頻率，評價噬菌體雞尾酒制劑的安全性，探討其抗耐藥結核病治療的潛力。
　　方法：
　　1.對噬菌體的形態(tài)、MOI、增殖周

2、期和寬噬率等生物學特性進行系統(tǒng)研究，從分枝桿菌噬菌體D29、33D、TM4、Legendre、DNAIII、BO4、Leo、Clark和Sedeg中初步篩選出裂解能力強、裂解譜廣的噬菌體，作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法配方噬菌體的備選項。
　　2.鳥槍法對初步篩選出的噬菌體進行全基因組測序，生物信息學進行基因預測及初步的基因注釋，以排除溶原性噬菌體和含有致病基因的噬菌體。
　　3.中和實驗和交叉中和實驗測定雞尾酒療法配方噬菌體

3、的吸附常數和交叉吸附常數以確定噬菌體自身的抗原性及噬菌體之間是否存在交叉吸附表位；通過體外殺菌(恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌)實驗，比較噬菌體雞尾酒療法與D29體外殺菌能力；終點滴定反濁法測定恥垢分枝桿菌對雞尾酒制劑配方噬菌體的耐藥突變頻率；改構噬菌體的劑型，將改構劑型與裸噬菌體分別對豚鼠滴鼻給藥，比較在不同時間點到達豚鼠肺部的噬菌體數量及其存活情況。
　　4.根據藥典行過敏檢查和熱源檢查，評估噬菌體雞尾酒制劑的安全性；巨噬細胞吞噬

4、噬菌體實驗，觀察噬菌體被巨噬細胞清除的過程；噬菌體雞尾酒制劑滴鼻實驗，觀察給藥期間小鼠活動情況和體重的變化，于給藥8周后對小鼠進行解剖，觀察臟器肉眼病變程度，同時行臟器病理組織學檢查。
　　結果：
　　1.噬菌體D29噬菌斑圓形透明，直徑5 nm；D29尾長129 nm；最佳MOI為10-4；D29感染宿主菌的潛伏期約為50 min，裂解量為10；D29能裂解所有受測結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體33D噬菌斑圓形透明，直徑2

5、 nm；33D尾長201 nm；最佳MOI為10-5；33D感染宿主菌的潛伏期約為150 min，裂解量為24；33D能裂解95.65％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體TM4噬菌斑圓形透明，直徑1.5nm；TM4尾長177 nm；最佳MOI為10-4；TM4感染宿主菌的潛伏期約為150 min，裂解量為28；TM4能裂解91.30％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Legendre噬菌斑圓形透明，直徑1 nm；Legendre尾長215

6、nm；最佳MOI為10-4；Legendre感染宿主菌的潛伏期約為180 min，裂解量為13；Legendre能裂解91.30％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體DNAIII噬菌斑渾濁，邊界模糊；DNAIII尾長208 nm；最佳MOI為10-4；DNAIII感染宿主菌的潛伏期約為165 min，裂解量為28；DNAIII能裂解78.26％結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體BO4噬菌斑圓形透明，直徑1 nm；BO4尾長215 nm；最佳MO

7、I為10-4；BO4感染宿主菌的潛伏期約為120 min，裂解量為37；BO4能裂解86.96％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Leo噬菌斑圓形透明，直徑1.5 nm；Leo尾長211 nm；最佳MOI為10-5；Leo感染宿主菌的潛伏期約為150 min，裂解量為74；Leo能裂解86.96％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Clark噬菌斑圓形渾濁，邊界模糊；Clark尾長227 nm；最佳MOI為10-4；Clark感染宿主菌的潛伏

8、期約為150min，裂解量為26；Clark能裂解82.61％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。噬菌體Sedeg噬菌斑圓形渾濁，邊界模糊；Sedeg尾長233 nm；最佳MOI為10-4；Sedeg感染宿主菌的潛伏期約為120 min，裂解量為39；Sedeg能裂解52.17％的結核分枝桿菌臨床耐藥株。根據噬菌體基本生物學特性初步篩選出噬菌體D29、33D、TM4和Legendre作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法的候選噬菌體。
　　2.采用鳥

9、槍隨機測序法對噬菌體33D測序，組裝出一條長50036bp的線性雙鏈DNA序列。采用glimmer在線分析軟件分析，確定33D有84個推定基因。對這些基因進行逐個BLAST同源檢索分析，得到17個已知功能的基因。gene6、gene7、gene8、gene9和gene14為噬菌體DNA復制相關基因；gene28(WhiB)為調節(jié)基因；gene47(Lysin B)和gene48(Lysin A)為裂解酶基因；gene57、Gene59、

10、gene60、gene61、gene64、gene70、gene74、gene75和gene76為噬菌體的結構基因。生物信息學分析確定噬菌體33D為裂解性噬菌體，33D噬菌體基因組無致病基因。
　　采用鳥槍隨機測序法對噬菌體Legendre測序，組裝出一條長40733 bp的線性雙鏈DNA序列。采用glimmer在線分析軟件分析，確定Legendre有58個推定基因。對這些基因進行逐個BLAST同源檢索分析，得到19個已知功能的基

11、因。gene25 RDF、gene26(Repressor)和gene27(Integrase)編碼與噬菌體溶源化相關的整合酶-阻遏蛋白系統(tǒng)；gene31(Lysin B)和gene32(Lysin A)為裂解酶基因；gene39、gene41、gene42、gene43、gene44、gene45、gene46、gene52、gene53、gene56和gene57為噬菌體的結構基因。Legendre的gene26阻遏蛋白與噬菌體BP

12、s、angle和Halo的編碼阻遏蛋白的gene33完全一致，Legendre與噬菌體BPs、angle和Halo一樣屬于溶原性噬菌體，不能入選雞尾酒療法。
　　3.噬菌體D29、33D和TM4對溫度、紫外線、酸堿和酒精均敏感。與pH7.4的固體培養(yǎng)基比較培養(yǎng)基pH5時不會影響D29裂解宿主菌；雖然在pH5的環(huán)境中33D裂解宿主菌的能力嚴重受損，但是依然有部分噬菌體能裂解宿主菌；TM4在pH5培養(yǎng)基中不能侵染宿主菌形成噬菌斑。

13、r>　　D29的K值為1070；33D的K值為704；TM4的K值為234。噬菌體D29、33D和TM4，TM4的抗原性最低。噬菌體D29、33D和TM4之間不存在交叉吸附表位，通過不同途徑感染宿主。
　　噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)抑制恥垢分枝桿菌的能力明顯強于單一噬菌體D29(P<0.05)；噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)殺滅和抑制耐藥結核分枝桿菌的能力明顯強于單一噬菌體D29(P<0.05)。

14、>　　恥垢分枝桿菌對噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)的耐藥突變率為10-8明顯低于對單一噬菌體D29的耐藥突變率10-6。
　　利用恥垢分枝桿菌mc2155無毒株作為保護載體(保護劑組)，觀察發(fā)現給藥后1 h和4 h保護劑組的噬菌體在小鼠氣管和肺部的滴度均明顯高于裸噬菌體組(P<0.05)。表明在豚鼠體內恥垢分枝桿菌對噬菌體有顯著的保護作用。
　　4.過敏實驗發(fā)現，第14天激發(fā)后粗制噬菌體組有兩只豚鼠均出現不同程度

15、的過敏現象；純化噬菌體組豚鼠在第14天和第21天激發(fā)后均未出現任何過敏現象。熱原檢查實驗發(fā)現，新西蘭白兔在注射供試品(純化噬菌體D29、33D和TM4)后體溫無明顯變化。
　　通過熒光雙標實驗，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現噬菌體與巨噬細胞作用10 min后被巨噬細胞吞噬，作用15 min后巨噬細胞內形成少量噬菌體-吞噬溶酶體，作用20 min后形成大量噬菌體-吞噬溶酶體，作用48 h噬菌體完全被巨噬細胞清除。
　　分別采用噬

16、菌體雞尾酒制劑(50μL/200μL)或生理鹽水(50μL/200μL)滴鼻后，各組小鼠進食量、活動量基本正常。在暴露8周后，各組動物的體重無明顯差異(P>0.05)。給藥8周后，解剖小鼠，肉眼觀察各組動物的臟器，肺臟、脾臟、肝臟均未見明顯異常；在顯微鏡下觀察肺臟、肝臟、脾臟的組織病理切片，均未見明顯異常。
　　結論：
　　分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑(D29、33D和TM4)具有比單一噬菌體(D29)更強的殺滅耐藥結核分枝桿菌