結核分枝桿菌PPE家族基因Rv3425應用于抗結核病疫苗的研究.pdf

1、結核病(Tuberculosis,TB)作為一種可治療和可預防的疾病,仍然導致每年200萬到300萬人死亡。而BCG保護效果的不穩(wěn)定(O～8096),HIV/AIDS的蔓延,發(fā)展中國家公共衛(wèi)生基礎設施的沒落以及耐多藥結核分枝桿菌的出現(xiàn)導致結核病的迅速傳播?，F(xiàn)有的以疫苗接種和藥物治療為基礎的TB控制戰(zhàn)略也不能夠抑制這種疾病尤其是耐藥結核分枝桿菌的傳播。所以作為全球性健康干預措施,開發(fā)更有效的抗結核病疫苗刻不容緩。
　　 最近比較基

2、因組學和生物信息學表明除了RD1,還有11個基因組區(qū)域在結核分枝桿菌中保守存在,而在BCG疫苗株中是缺失的,這些缺失區(qū)包括了Mycobacterium tuberculosis H37Rv 108個ORFs。最近已經(jīng)有不少研究證明,RDl區(qū)和其他的RD區(qū)編碼的蛋白具有發(fā)展成為疫苗和診斷試劑的潛力。結核分枝桿菌基因組中大約有10％的ORFs編碼了PE和PPE家族蛋白,它們是富含甘氨酸且M.tuberculosis特有的蛋白。由于PE/PP

3、E家族蛋白在序列和可能結構上的獨特性,推測它們有可能具有比較重要的免疫學意義。盡管這兩個大家族蛋白在抗結核分枝桿菌的免疫反應中的作用研究得還不是很清楚,不過現(xiàn)在已經(jīng)有了一些關于PE/PPE蛋白免疫特性的報道。
　　 本項研究中基于BCG免疫缺陷原因的分析以及應對策略選取了RD區(qū)中所有PPE家族蛋白(7個),經(jīng)過計算機分析以及文獻資料綜合評價選取了在M.tuberculosis中保守存在,而在BCG中缺失的PPE家族成員——Rv3

4、425,對其應用于抗結核疫苗的潛力進行評價。研究工作主要包括以下幾部分:
　　 1.重組Rv3425蛋白免疫特性的研究。用純化的重組Rv3425蛋白100μg和弗氏不完全佐劑(incomplete freund's adjuvant,IFA)混合,隔周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,單獨用IFA免疫作為對照,最后1次免疫3周后,分別通過ELISPOT和ELISA方法檢測脾細胞分泌IFN-γ的能力,IFN-γ,TNFα,IL-4的

5、分泌量,以及血清中特異性抗體的水平。結果表明經(jīng)過重組Rv3425蛋白免疫之后,小鼠血清中IgG(H+L)、IgG1、IgG2a抗體水平均有所增強;免疫小鼠脾細胞受到特異性抗原刺激后,有較多的淋巴細胞可以分泌表達IFN-γ,并且Rv3425蛋白免疫組IFN-γ,TNFα的分泌量明顯高于IFA免疫對照組,而IL-4在兩個免疫組中都沒有檢測到。由此我們可以初步推論PPE蛋白Rv3425有較好的免疫特性,有可能應用于抗結核疫苗的設計。
　

6、　 2.分泌表達Ag85B和Rv3425融合蛋白的重組BCG菌株的篩選和免疫學特性的研究。BCG是很好的活的疫苗載體,可以誘導較強的細胞免疫和體液免疫反應。將一些重要的結核分枝桿菌抗原基因?qū)隑CG,讓BCG大量表達保護性抗原,有望誘導比BCG強大而又持久的免疫保護力。結核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白中的Ag85B是重要的保護性抗原,廣泛應用于新型結核病疫苗研究。本研究選擇結核分枝桿菌重要保護性抗原Ag85B以及PPE抗原Rv3425,通

7、過穿梭質(zhì)粒pMV261重組入BCG,構建了rBCG::Ag85B-Rv3425,該重組BCG是國內(nèi)外首次報道。
　　 用rBCG::Ag85B-Rv3425和BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后,通過分析小鼠脾細胞IFNγ的分泌水平,CD4+、CD8+T細胞所占的比例以及抗體IgG水平、IgG2a/IgG1,比較了重組BCG和BCG的免疫原性。研究結果表明,rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠可以引起較BCG免疫小鼠更多

8、的抗原特異性T細胞分泌IFN-γ。除此之外,rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠體液水平也有明顯增強,抗原特異性的IgG亞類分析發(fā)現(xiàn)在免疫之后的9周可以誘導出更高的IgG2a反應,暗示該重組疫苗引起的可能是具有保護性的Th1反應,這反過來又會促進保護性因子IFN-γ的分泌,這是抗結核疫苗成功的重要因素。因此我們也可以初步推論該重組疫苗rBCG::Ag85B-Rv3425可能成為抗結核的潛在候選疫苗。
　　 3.重組疫苗

9、rBCG::Ag85B-Rv3425對小鼠動物免疫保護效果的研究。皮下免疫C57BL/6小鼠,劑量為5×106cfu,9周后用結核分枝桿菌毒力標準株H37Rv尾靜脈攻擊,攻擊劑量為1×106cfu。攻擊后6周,9周,12周,觀察小鼠脾、肺中菌落計數(shù)、組織病理變化以及小鼠的存活率和攻毒前后體重的變化。研究結果顯示rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部菌落數(shù)較BCG免疫組有差異(p＜0.05),抗酸染色顯示rBCG::Ag85B

10、-Rv3425免疫的小鼠肺部組織的結核桿菌數(shù)較BCG免疫組也少。我們可以看出,與BCG相比,rBCG::Ag85B-Rv3425能夠產(chǎn)生相當甚至更好的保護作用。在我們的實驗觀察時間內(nèi),BCG免疫組和rBCG::Ag85B-Rv3425免疫組在小鼠存活率方面沒有明顯差異,為此我們的重組疫苗小鼠毒力攻擊保護實驗正在武漢大學三級生物安全動物進行長時間毒力株攻擊后觀察來區(qū)分重組BCG與BCG疫苗的保護效率差異。
　　 綜上所述,PPE蛋