過表達結(jié)核分枝桿菌HspX蛋白的重組卡介苗的保護效應(yīng).pdf

1、背景與目的：
　　 Ag85B蛋白是結(jié)核分枝桿菌（M．Tb）對數(shù)生長期分泌的保護性抗原，過表達Ag85B的重組卡介苗（rBCG）可以誘導(dǎo)比卡介苗（BCG）更強的抗M．Tb保護效應(yīng)，并已在國外完成I期臨床試驗。HspX蛋白是M．Tb在體外穩(wěn)定期或體內(nèi)休眠狀態(tài)表達的優(yōu)勢蛋白；在氧耗盡或感染巨噬細(xì)胞后，BCG只表達微量的HspX。HspX蛋白能誘導(dǎo)M．Tb感染者機體產(chǎn)生強烈的Th1型免疫應(yīng)答。BCG免疫后，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對M．Tb

2、對數(shù)生長期分泌的保護性抗原的Th1應(yīng)答，但不會引起針對HspX特異性的IFN-γ免疫反應(yīng)。尚不清楚HspX蛋白能否用于研制rBCG。我們鑒定了過表達HspX蛋白的rBCG菌株（rBCG::X）、過表達Ag85B蛋白的rBCG菌株（rBCG::85B）和含有空載體pMV261的rBCG菌株（rBCG::261）等三個重組疫苗，將這些疫苗免疫小鼠，評價了它們的免疫原性和免疫保護性。
　　 方法：
　　 1．在NCBI 網(wǎng)站用

3、BLASTn分析方法對M．Tb的hspX基因序列進行生物信息學(xué)分析；
　　 2．IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白Ag85B和HspX的原核表達，并進行純化和鑒定，純化蛋白用于疫苗的免疫原性分析；
　　 3．對rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261 進行傳代培養(yǎng)，利用Western blotting鑒定這三個重組菌株的培養(yǎng)上清和菌體裂解液，分析Ag85B和HspX 蛋白表達情況和穩(wěn)定性；
　　 4．將rBCG

4、::X、rBCG::85B和rBCG::261分別免疫C57BL/6 小鼠，免疫后6周和24周，分別用ELISA 檢測小鼠抗原特異性IgG 抗體和用ELISPOT 檢測脾淋巴細(xì)胞分泌抗原特異性IFN-γ水平；
　　 5．將rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分別免疫BALB/c和C57BL/6 小鼠，小鼠免疫6周后，進行M．Tb H37Rv 毒株攻擊感染，感染4周后，分別檢測小鼠脾臟和肺臟的荷菌量以及肺臟病理改

5、變，比較評價重組疫苗對不同種屬小鼠的保護性。攻擊感染18周后，分別檢測C57BL/6 小鼠脾臟和肺臟的荷菌量以及肺臟病理改變，比較評價重組疫苗對C57BL/6 小鼠的短期和長期保護性。
　　 結(jié)果：
　　 1．hspX基因生物信息學(xué)分析顯示，與M．Tb H37Rv 菌株的hspX基因核苷酸序列一致性達100％的有7 株細(xì)菌，均屬于M．Tb 復(fù)合體和BCG，包括一株MDR-TB 菌株；
　　 2．重組蛋白HspX和

6、Ag85B 原核表達純化過程的SDS-PAGE和純化蛋白的Western blotting，證實純化蛋白具有較高的純度和蛋白活性；
　　 3．重組疫苗的培養(yǎng)上清和菌體裂解液的Western blotting 顯示，rBCG::X在菌體裂解液中表達較高水平的HspX，培養(yǎng)上清中則有較高水平的Ag85B，且表達是穩(wěn)定的；
　　 4．rBCG 免疫C57BL/6 小鼠后，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。血清IgG

7、抗體ELISA 檢測顯示，與rBCG::261 免疫小鼠比較，rBCG::X免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的HspX和Ag85B 抗原特異性IgG 抗體（p＜0.05）。IFN-γ ELISPOT 檢測顯示，rBCG::X 實驗組在免疫后6周和24周，HspX和Ag85B 蛋白特異性的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)比rBCG::261 實驗組高（p＜0.05）；
　　 5．在攻擊感染后4周和18周的荷菌量分析顯示，與rBCG::261 免疫小鼠相

8、比，rBCG::X 免疫小鼠在抵抗M．Tb 感染時產(chǎn)生更加持久的保護效應(yīng)，肺臟的荷菌量更少（p＜0.05），病理變化更輕微。比較rBCG::X和rBCG::85B 疫苗的保護效應(yīng)，rBCG::X 免疫小鼠肺臟的荷菌量有輕度顯著下降（p＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1．rBCG::X引起更高更持久的保護性可能與以下原因有關(guān)：過表達HspX蛋白可能使rBCG::X形成更厚的細(xì)胞壁，在體內(nèi)持留時間延長；過表達的HspX和