共表達結核分枝桿菌CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原重組腺病毒的構建及免疫學評價.pdf

1、結核?。═uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性致死性人獸共患性傳染病。該病傳染性強，潛伏期長，致死率高，是嚴重危害人類健康的三大傳染性疾病之一。牛分枝桿菌減毒株 BCG（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin，BCG）作為目前唯一的抗結核疫苗，在全世界范圍內廣泛使用，對人類預防結核病發(fā)揮了巨大的作用，

2、但其所能提供的免疫保護力有限。雖然目前已經(jīng)有很多新型抗結核疫苗處于實驗研究階段，但是仍然沒有新疫苗可取代 BCG。鑒于目前抗結核病疫苗的研究現(xiàn)狀，為了能誘導機體產(chǎn)生更有效的免疫應答，近年來，國內外學者開展了病毒載體疫苗的研究，其中腺病毒載體是頗受關注的研究熱點之一。本論文的目的在于采用人5型腺病毒（Human adenovirus serotype5，Ad5）構建共表達結核分枝桿菌優(yōu)勢抗原基因CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85

3、B的重組腺病毒載體Ad5-CEAB，并以小鼠為動物模型研究重組腺病毒Ad5-CEAB的免疫原性，這不僅具有重要的科學意義，研究結果也將為抗結核新型疫苗的研制提供理論依據(jù)。
　　首先，我們選取了4種結核分枝桿菌優(yōu)勢抗原 CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B基因，構建了一種可同時表達這4種抗原的真核多基因共表達載體pcDNA-CMV-CFP10-linker-ESAT6-RSV-Ag85A-IRES-Ag85B（pcDNA-

4、CEAB）。測序驗證后再用限制性內切酶將 CFP10-linker-ESAT6-RSV-Ag85A-IRES-Ag85B片段整體從質粒pcDNA-CEAB中切下，插入到腺病毒穿梭質粒pacAd5 CMV K-N pA vector中，與腺病毒骨架質粒pacAd59.2-100 Ad backbone vector共轉染HEK293T細胞進行病毒包裝，獲得重組腺病毒Ad5-CEAB。重組腺病毒Ad5-CEAB經(jīng)Western blotti

5、ng驗證后進行大量擴增，并用氯化銫密度梯度離心法進行病毒純化，獲得了高滴度的重組病毒Ad5-CEAB。
　　然后，我們以小鼠為動物模型對重組腺病毒Ad5-CEAB的免疫原性進行了評價。實驗以PBS和BCG作為對照，用Ad5-CEAB免疫小鼠3次，末免2周后處死小鼠進行免疫學評價。結果表明，Ad5-CEAB可以刺激小鼠產(chǎn)生較強的抗原特異性免疫應答反應，尤其是Th1型細胞免疫應答反應。表現(xiàn)在，Ad5-CEAB免疫小鼠后，淋巴細胞抗原刺

6、激液中的IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12濃度顯著高于PBS組和BCG組。另外，Ad5-CEAB組小鼠血清抗體IgG和IgG2a/IgG1顯著高于對照組。實驗還測定了小鼠呼吸道黏膜分泌型IgA（secretary IgA，sIgA）的濃度，結果顯示，Ad5-CEAB組小鼠肺盥洗液中sIgA的濃度顯著高于對照組?？傊?，Ad5-CEAB免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產(chǎn)生較強的呼吸道黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應答，這些指標和對照組相比，

7、均有顯著的變化。
　　最后，我們以小鼠為動物模型，采用BCG初免-Ad5-CEAB加強的異源初免-加強的免疫策略，評價Ad5-CEAB作為BCG的加強型候選疫苗，是否具有加強BCG免疫效果的作用。結果表明，Ad5-CEAB可以顯著的加強BCG的免疫效果。主要表現(xiàn)在，BCG初免-Ad5-CEAB加強免疫后，小鼠淋巴細胞經(jīng)抗原刺激后，會分泌高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，這三種細胞因子的濃度均顯著高于PBS組和BCG組。BC

8、G初免-Ad5-CEAB加強后，還可以有效的刺激小鼠分泌IgG抗體，血清IgG抗體濃度顯著高于對照組。另外，小鼠肺盥洗液中sIgA濃度也顯著高于對照組。說明采用BCG初免-Ad5-CEAB加強的異源初免-加強的免疫策略能夠有效的刺激小鼠產(chǎn)生呼吸道黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應答。此外，我們還比較了BCG初免后，用Ad5-CEAB加強1次和加強2次的免疫效果。結果表明，Ad5-CEAB加強1次也能刺激小鼠產(chǎn)生較強的免疫應答反應，尤其是黏膜

9、免疫應答和細胞免疫應答。
　　綜上所述，本論文成功的構建了重組腺病毒載體Ad5-CEAB，該病毒采用了雙啟動子表達的策略，利用CMV啟動子和(Gly4Ser)3蛋白linker實現(xiàn)了CFP10和ESAT6的融合表達，利用RSV啟動子和IRES序列實現(xiàn)了Ag85A和Ag85B蛋白的獨立表達。最終，在同一個病毒載體中共表達了4種結核分枝桿菌優(yōu)勢抗原基因。通過動物實驗證明我們構建的重組腺病毒Ad5-CEAB具有很強的刺激機體產(chǎn)生局部黏膜

10、免疫、細胞免疫和體液免疫應答反應的能力。另外，Ad5-CEAB還可以加強BCG的免疫效果。本研究制備的重組腺病毒載體Ad5-CEAB被實驗證明具有很好的免疫原性。我們將在以后的研究中繼續(xù)對Ad5-CEAB開展深入的研究，主要包括在其他動物模型中繼續(xù)驗證，條件成熟后進行強毒株攻毒保護實驗等。Ad5-CEAB有望成為一種新型的抗結核候選疫苗，BCG初免-Ad5-CEAB加強的異源初免-加強的免疫策略也有望成為一種新型的抗結核免疫策略，值得更