約氏瘧原蟲SLARP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫活性分析.pdf

1、目的：
　　 瘧疾(malaria)是世界上危害最嚴(yán)重的寄生蟲病之一,在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率,全球受瘧疾威脅的人口超過(guò)30億。瘧原蟲(Pjasmodium)是引起瘧疾的病原體,是一類單細(xì)胞、寄生性的原生動(dòng)物。在大多數(shù)瘧疾流行區(qū),由于抗藥性蟲株和耐藥性蚊媒的不斷產(chǎn)生和擴(kuò)散,使得瘧疾防治難度不斷加大。因而,迫切需要研制出有效的瘧疾疫苗。瘧原蟲生活史復(fù)雜,不同階段引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原也不同。此外還有種株的差異以及瘧原蟲自

2、身的免疫逃避等原因,給瘧疾疫苗的研制帶來(lái)了重重困難。目前在研究中的大多數(shù)疫苗都只是針對(duì)瘧原蟲的紅內(nèi)期或蚊體階段,不能全面地控制瘧疾。瘧原蟲的基因比細(xì)菌病毒的基因大得多,其候選抗原也多,但很多抗原所產(chǎn)生的免疫保護(hù)性不強(qiáng)。僅惡性瘧原蟲的抗原就有5300多種,但在已鑒定的約40個(gè)疫苗候選抗原中能產(chǎn)生強(qiáng)而持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原卻十分有限。
　　 針對(duì)目前瘧疾疫苗研制中存在的這些問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)以約氏瘧原蟲編碼紅外期肝階段的SLARP基因

3、為抗原基因,構(gòu)建pcDNA3.1(+)-SLARP真核表達(dá)載體,觀察該載體能否在真核細(xì)胞中表達(dá)及其對(duì)動(dòng)物的免疫效果。以期篩選出一種有效的瘧疾疫苗候選抗原,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)阻斷瘧疾感染的核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、構(gòu)建poDNA3.1(+)-SLARP真核表達(dá)載體
　　 設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以pGEX6p-1-SLARP質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增SLARP片段并回收。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切擴(kuò)增的

4、目的片段及pcDNA3.1(+)載體,回收后用T4連接酶將二者連接,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-SLARP真核表達(dá)載體。HandⅢ/PstⅠ雙酶切構(gòu)建的載體電泳鑒定并進(jìn)行測(cè)序分析。
　　 二、pcDNA3.1(+)-SLARP表達(dá)載體在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
　　 將構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS7,培養(yǎng)48小時(shí)后間接免疫熒光檢測(cè)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 三、SLARP基因真核表達(dá)載體在動(dòng)物體內(nèi)免疫

5、活性的檢測(cè)
　　 (一)動(dòng)物免疫
　　 BALB/c純系雌性小白鼠51只,隨機(jī)分為三組,每組各17只,分別命名為pcDNA3.1(+)-SLARP組、pcDNA3.1(+)空載體對(duì)照組、PBS對(duì)照組。免疫前在小鼠左后肢股四頭肌注射鹽酸利多卡因0.25mg/只。三天后同一部位分別注射pcDNA3.1(+)-SLARP質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)空載體、PBS。每三周加強(qiáng)免疫一次,共免疫三次。
　　 (二)血清特異性

6、抗體及細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　 每次免疫后兩周,收集各組小鼠的血清及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清。用ELISA法檢測(cè)各組血清中特異性IgG抗體及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b水平,檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±SD)表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn),P＜

7、0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、pcDNA3.1(+)-SLARP重組載體的鑒定
　　 所得的重組載體經(jīng)HandⅢ/PstⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳,獲得兩條大小約為4003bp和1915bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序分析所得結(jié)果與Genebank中SLARP基因序列比對(duì),同源性達(dá)100%。
　　 二、pcDNA3.1(+)-SLARP表達(dá)載體在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
　　

8、將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后,可在細(xì)胞漿中觀察到綠色熒光,對(duì)照組則無(wú)綠色熒光。說(shuō)明該重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞COS7中正常表達(dá)。
　　 三、SLARP基因真核表達(dá)載體在動(dòng)物體內(nèi)免疫活性的檢測(cè)
　　 ELISA結(jié)果顯示,SLARP基因真核表達(dá)載體免疫組的小鼠產(chǎn)生的IgG抗體及其亞類IgGl、IgG2a、IgG2b水平明顯升高,細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平明同樣升高明顯,均高于兩對(duì)照組(P＜0.05)