CDs表達的TLR4-9在約氏瘧原蟲感染早期的免疫調(diào)控作用.pdf

1、瘧疾是由瘧原蟲感染引起的最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病。嚴重的瘧疾疫情正是造成發(fā)展中國家兒童高死亡率和成人高發(fā)病率的主要原因。而瘧原蟲抗原變異和耐藥性原蟲的出現(xiàn)，又進一步阻礙了瘧疾疫苗的研制和抗瘧藥物的開發(fā)。因此，尋求新的瘧疾疫苗靶點將無疑是瘧疾控制的重中之重。
　　 嚙齒類瘧原蟲感染小鼠為深入探討抗人瘧保護性免疫應(yīng)答機制，提供了一種寶貴的實驗動物模型。約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染的不

2、同小鼠，會呈現(xiàn)不同的Th1細胞免疫應(yīng)答模式，因而導致其出現(xiàn)自愈和死亡兩種截然相反的感染結(jié)局。因此，瘧疾感染早期Th1細胞免疫應(yīng)答的有效建立明顯影響著感染進程和最終結(jié)局。在這一過程中，DCs是決定Th免疫應(yīng)答的關(guān)鍵效應(yīng)細胞。作為活化樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)眾多效應(yīng)分子之一的Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）對于其成熟和功能發(fā)揮起著舉足輕重的作用。同時嚙齒類研究表明，TLR2/4可通過

3、識別瘧原蟲錨定在糖復合物上的糖基化磷酯酰肌醇（glycosylphospatidylinositol，GPI）誘導炎癥因子產(chǎn)生，而瘧原蟲成份之一的瘧色素可通過TLR9啟動天然免疫應(yīng)答。
　　 我們利用成功建立的P.y17XL感染的BALB/c和DBA/2鼠瘧模型，分析了參與抗瘧免疫應(yīng)答調(diào)控的相關(guān)因素。前期的研究結(jié)果顯示，兩種不同易感性的小鼠在感染過程中，TLR4/9表達程度不盡相同。本研究通過外源性給予TLR4/9激動劑或抑制劑

4、，動態(tài)觀察其對于不同易感性小鼠感染模式及結(jié)局的影響、免疫效應(yīng)細胞及產(chǎn)生細胞因子的變化，以期為瘧疾疫苗開發(fā)提供新的靶點。
　　 實驗方法：
　　 1、實驗動物、瘧原蟲及主要試劑
　　 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠、DBA/2小鼠由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供（許可證編號：SCXK京200420001）；P.y17XL（同本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈）；LPS購自Sigma公司(St. Louis，MO，

5、USA)；TLR9激動劑CpG1826及其對照組CpG1982（Takara合成）；TLR9抑制劑H154及其對照組A151(Takara合成)。
　　 2、動物分組與TLR4/9激動劑抑制劑處理及感染
　　 (1)P.y17XL不同易感程度鼠瘧模型：易感型BALB/c小鼠和抵抗型DBA/2小鼠；
　　 (2)TLR9激動劑及其對照組處理組模型：感染前2d，分別經(jīng)脛骨前肌肉注射給易感型BALB/c小鼠：TLR9激

6、動劑易感型BALB/c小鼠；CpG1826，50μg/只；TLR9激動劑對照組CpG1982，50μg/只；
　　 (3)TLR4激動劑處理組模型：感染后第2d易感型BALB/c小鼠經(jīng)鼠尾靜脈注射TLR4激動劑LPS，25μg/只；
　　 (4)TLR9抑制劑及其對照組處理組模型：感染前1d，分別經(jīng)腹腔注射給予抵抗型DBA/2小鼠：TLR9抑制劑H154，3mg/kg;TLR9抑制劑對照組A151，3mg/kg;

7、　　 上述小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細胞，感染不同時間小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率，并每同觀察生存率。
　　 3、脾細胞培養(yǎng)
　　 不同鼠瘧模型小鼠于感染0d、3d和5d常規(guī)無菌摘取脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液。用含10％FCS的RPMI1640調(diào)整脾細胞終濃度至1×107個/ml，24孔培養(yǎng)板(FALCON)，每孔加入500μl細胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)4

8、8h。350×g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待細胞因子測定。
　　 4、流式細胞儀檢測小鼠脾臟細胞檢測
　　 FACS檢測CD11c+TLR4+DCs、CD11c+TLR9+DCs、CD11c+CD11b+DCs(mDCs)、CD11c+B220+DCs(pDCs)、CD4+CD69+T細胞、CD4+CD25+Foxp3+T細胞(Tregs)。
　　 5、細胞因子檢測
　　 雙抗體夾心EL

9、ISA法對小鼠脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-10的含量分別進行檢測，酶標儀(InterMedNJ-2100)測定450nm處OD值。繪制標準曲線，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 6、統(tǒng)計學分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、TLR4/9激動劑對P.y17XL感染BALB/c小鼠感染模式的影響
　　

10、TLR4激動劑LPS處理組，與對照組相比，實驗組小鼠原蟲血癥水平緩慢上升，于感染后第16d達到峰值，峰值為21.12％，生存率為66.67％。TLR9激動劑處理組，實驗組及對照組小鼠原蟲血癥水平迅速持續(xù)升高，一同于感染后第5d達到60～70％，并于感染后第5d-7d全部死亡。
　　 2、TLR4/9激動劑對抗Py17XL感染免疫過程中相關(guān)免疫細胞的影響
　　 與感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染組小鼠

11、脾臟表達TLR9的DCs細胞、DCs亞群及Tregs均顯著升高，脾臟表達TLR4的DCs和脾臟細胞內(nèi)CD4+CD69+T細胞未見有意義的變化。感染后3d和5d，TLR4激動劑LPS處理組小鼠脾臟表達TLR4的CD11c+DCs、DCs亞群及CD4+CD69+T細胞百分比顯著高于正常感染組小鼠，Tregs百分比顯著低于正常感染組。TLR9激動劑處理組小鼠脾臟表達TLR9的CD11c+DCs百分比顯著高于正常感染小鼠及對照組。DCs亞群、C

12、D4+CD69+T細胞及Tregs與之相比未見有意義的改變。
　　 3、TLR4/9激動劑對P.y17XL感染免疫過程中相關(guān)免疫分子的影響
　　 與感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10分泌顯著升高。感染后3d和5d，TLR4激動劑LPS處理后的感染小鼠在相應(yīng)時間點上脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ顯著高于正常感染組，IL-10的分泌量顯著低于正常感染組。TLR9激動

13、劑與之相比脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-10未出現(xiàn)有意義的變化。
　　 4、TLR9抑制劑對P.y17XL感染DBA/2小鼠感染模式的影響
　　 經(jīng)P.y17XL感染后第2d，所有小鼠外周血中均出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細胞。未經(jīng)TLR9抑制劑H154處理的小鼠原蟲血癥水平上升平緩，于第6d和第14d達到峰值，峰值分別為15.56和15.57。隨后小鼠全部自愈。而經(jīng)TLR9抑制劑H154處理的小鼠，原蟲血癥水平上升迅速，于感

14、染后第11d才達到峰值，峰值為39.47％，隨后原蟲血癥水平下降，至感染后第19d部分小鼠自愈，小鼠生存率為33.33％。
　　 5、TLR9抑制劑對P.y17XL感染免疫過程中相關(guān)免疫細胞的影響
　　 與感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染組小鼠脾臟表達TLR9的DCs細胞、DCs亞群、CD4+CD69+T細胞及Tregs均明顯升高。感染后第3d，TLR9抑制劑處理組小鼠脾臟表達TLR9的CD11c+

15、DCs及CD4+CD69+Tcells百分比顯著低于正常感染及對照組。感染后第3d和5d，TLR9抑制劑處理組小鼠脾臟DCs亞群的百分比顯著低于正常感染及對照組。感染后第5d，TLR9抑制劑處理組小鼠脾臟Tregs的百分比顯著低于正常感染及對照組。
　　 6、TLR9抑制劑對P.y17XL感染免疫過程中相關(guān)免疫分子的影響
　　 與感染前相比P.y17XL感染后第3d，正常感染組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-10分