惡性瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子期表面抗原單鏈抗體基因的改造、原核表達(dá)及其轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：蚊蟲(chóng)可傳播許多嚴(yán)重的人類(lèi)疾病，其中，瘧疾更是目前世界上最普遍也是最致命的疾病之一，每年全球約有5億人被瘧疾感染，估計(jì)死亡人數(shù)有270萬(wàn)，是WHO公布的“十大重點(diǎn)防治的疾病”之一，2005年我國(guó)報(bào)告瘧疾發(fā)病42319例，發(fā)病率為0.59/萬(wàn)。由于對(duì)瘧疾缺乏有效的疫苗，一直以來(lái)對(duì)瘧疾的預(yù)防主要是通過(guò)蚊媒的控制來(lái)阻斷其傳播。DTT、溴氰菊酯等化學(xué)殺蟲(chóng)劑的研制成功曾經(jīng)給蚊媒病的防治帶來(lái)一線曙光，但隨著蚊蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生，這個(gè)幻想又破滅了

2、。而瘧原蟲(chóng)耐藥性的出現(xiàn)意味著控制蚊媒再一次成為最有效且實(shí)用的減輕瘧疾負(fù)擔(dān)的方法，但研制新化學(xué)藥物所需費(fèi)用昂貴及使用殺蟲(chóng)劑對(duì)環(huán)境造成污染等方面的問(wèn)題，迫使人們?nèi)ふ倚碌耐緩絹?lái)控制蚊媒?，F(xiàn)代分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展給瘧疾的防治帶來(lái)了新的方法：這種方法主要是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一些效應(yīng)分子基因插入到蚊蟲(chóng)的基因組中，然后在特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下大量高效表達(dá)，從而起到影響瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育甚至將其殺死的作用。 瘧原蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因蚊的研究經(jīng)歷了二十

3、幾年的發(fā)展，如今已經(jīng)形成了一套比較成熟的技術(shù)手段，如有效的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染體系、合適的報(bào)告基因、有效的組織與時(shí)期特異性啟動(dòng)子和有效的基因?qū)敕椒ǖ?。在這些技術(shù)支持的基礎(chǔ)上，需要選擇合適的效應(yīng)分子，使之在基因修飾蚊蟲(chóng)體內(nèi)有效表達(dá)并發(fā)揮抗瘧作用。根據(jù)瘧原蟲(chóng)的生活史，動(dòng)合子期是瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)發(fā)育的最薄弱環(huán)節(jié)，因此，選擇這個(gè)時(shí)期作為靶標(biāo)對(duì)其進(jìn)行攻擊具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Pfs25是惡性瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子期表達(dá)的一種最主要的表面抗原，研究顯示，抗Pfs25的單鏈抗

4、體487能明顯阻斷蚊體內(nèi)瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子發(fā)育成卵囊。本課題組欲嘗試以單鏈抗體487作為效應(yīng)分子構(gòu)建瘧原蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因蚊，然而先前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，487在轉(zhuǎn)基因蚊體內(nèi)的表達(dá)效果并不理想。因此我們嘗試對(duì)487的編碼基因進(jìn)行改造，在不改變其編碼的氨基酸序列基礎(chǔ)上，根據(jù)宿主(按蚊)的密碼子偏嗜情況對(duì)487基因的堿基序列進(jìn)行修改，并將修改后的487基因(m487)與按蚊本身的免疫效應(yīng)分子CecropinA基因連接，構(gòu)建融合基因Cep&m487；然后將Cep

5、&m487基因序列克隆入pET32a(+)載體中進(jìn)行原核表達(dá)，初步鑒定其體外生物活性；并把Cep&m487基因連接入帶有眼特異性啟動(dòng)子(3x3p)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物、岡比亞按蚊羧肽酶(Anophelesgambiaecarboxypeptidase，AgCP)啟動(dòng)子及piggyBac轉(zhuǎn)座元件的重組轉(zhuǎn)化載體，用顯微注射的方法將其注入新鮮蚊卵中用以觀察其轉(zhuǎn)化效果。 目的： 1.改造抗惡性瘧原蟲(chóng)Pf

6、s25單鏈抗體487的編碼基因； 2.原核表達(dá)改造后的融合基因Cep&m487，并對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行初步的體外生物學(xué)活性鑒定； 3.構(gòu)建由眼異性性啟動(dòng)子(3x3p)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物、AgCP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子抗體基因及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487； 4.用顯微注射的方法將重組載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Ce

7、p&m487注入新鮮蚊卵中并觀察其轉(zhuǎn)化效果。 方法： 1.比較岡比亞按蚊和小鼠的密碼子使用頻率，將鼠源性487基因中按蚊的稀有密碼子替換成按蚊偏好的密碼子； 2.將按蚊本身的免疫效應(yīng)分子CecropinA基因與修改后的487連接，構(gòu)建并合成融合基因Cep&m487。 3.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Cep&m487，利用酶切、連接反應(yīng)構(gòu)建pET32a(+)-Cep&m487重組質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR酶切鑒定和測(cè)序分析；

8、 4.將重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cep&m487轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化； 5.WesternBlot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性； 6.瓊脂糖擴(kuò)散法初步檢測(cè)重組蛋白的體外抑菌活性。 7.設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，通過(guò)酶切，連接等方法，將融合基因Cep&m487經(jīng)穿梭質(zhì)粒pSlfal180fa連接到AgCP啟動(dòng)子下游，然后將AgCP-Cep&m487克隆入轉(zhuǎn)移載體pBac[3x3

9、p-DsRedafm]，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487。 8.運(yùn)用顯微注射技術(shù)將重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487注入新鮮的蚊卵； 9.對(duì)孵化出的幼蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化效果的初步分析。 結(jié)果： 1.成功對(duì)鼠源性抗惡性瘧原蟲(chóng)Pfs25單鏈抗體487的編碼基因進(jìn)行了改造。 2.成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32(+)-Cep&m487，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白主要以包

10、涵體形式高效表達(dá)，WesternBlot結(jié)果顯示重組蛋白與抗6-his-tag抗體具有特異的免疫反應(yīng)性；瓊脂糖擴(kuò)散法顯示重組蛋白無(wú)體外抑菌活性。 3.構(gòu)建出由眼異性性啟動(dòng)子(3x3p)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物、AgCP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子抗體基因及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487。 4.微注射了1000只蚊卵，孵化率達(dá)5％，熒光顯

11、微鏡下沒(méi)有觀察到表面篩選標(biāo)記陽(yáng)性(紅色眼)的個(gè)體。 結(jié)論： 1.構(gòu)建了融合的抗惡性瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子抗體基因Cep&m487； 2.該基因在E.coli中高效表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白與抗6-his-tag抗體具有特異的免疫反應(yīng)性，重組蛋白純化后不顯示體外抑菌活性； 3.構(gòu)建出由眼特異性啟動(dòng)子(3x3p)驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標(biāo)志物、AgCP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗瘧原蟲(chóng)動(dòng)合子抗體基因及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件