惡性瘧原蟲海南株P(guān)NP基因的克隆、表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、瘧原蟲沒有從頭合成嘌呤的途徑,依靠補(bǔ)救合成途徑以利用現(xiàn)成嘌呤堿或嘌呤核苷.為滿足紅細(xì)胞內(nèi)期瘧原蟲大量裂體增殖,嘌呤補(bǔ)救合成十分活躍.參與嘌呤補(bǔ)救合成的酶有腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)等,其中PNP是關(guān)鍵酶.該研究對中國惡性瘧原蟲FCC1/HN分離株P(guān)NP基因進(jìn)行克隆表達(dá),并對其功能做了初步研究.方法從液氮罐中取出保存的惡性瘧原蟲FCC1/HN分離株復(fù)蘇,用人"B"型紅細(xì)胞懸液及含10％人"AB"型血清的RPMI1640培養(yǎng)液在

2、37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外連續(xù)培養(yǎng).當(dāng)惡性瘧原蟲密度達(dá)到5%~10%時收集蟲體并提取其基因組DNA.以基因組DNA作為模板擴(kuò)增出惡性瘧原蟲PNP基因,克隆入原核表達(dá)載體pET30a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-PNP.以上重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定和基因序列測定驗證.將重組質(zhì)粒pET30a(+)-PNP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中,在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)His-Taged融合蛋白,純化表達(dá)產(chǎn)物,并進(jìn)行SDS-PAGE分析和West