惡性瘧原蟲(chóng)動(dòng)力素相似蛋白1的功能研究.pdf

1、瘧疾是目前地球上對(duì)人類(lèi)危害最嚴(yán)重的蚊媒寄生原蟲(chóng)病。全世界每年有3至5億人受到瘧原蟲(chóng)感染，二百至三百余萬(wàn)人死于惡性瘧疾，其中80％是五歲以下兒童。瘧原蟲(chóng)是瘧疾的病原體，寄生于人體的瘧原蟲(chóng)共有4種，惡性瘧原蟲(chóng)是其中最致命的一種。由于惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)現(xiàn)有藥物的抗藥性不斷出現(xiàn)和蔓延，蚊媒對(duì)殺蟲(chóng)劑抗藥性的產(chǎn)生等因素影響，加上迄今尚無(wú)有效的瘧疾疫苗出現(xiàn)，致使對(duì)瘧疾的控制成為世界性的大難題之一。 對(duì)瘧疾的防治是多種多樣的，可以針對(duì)不同的發(fā)育階段和

2、傳播環(huán)節(jié)采取不同的措施。目前公認(rèn)最有發(fā)展前景的策略包括：1)能夠有效抑制瘧原蟲(chóng)的某一特殊生命過(guò)程的藥物；2)具有預(yù)防及治療作用的疫苗。 惡性瘧原蟲(chóng)動(dòng)力素相似蛋白1(Plasmodium falciparum dynamin like protein 1)是本實(shí)驗(yàn)篩選出的新蟲(chóng)源基因，前期工作證明其功能具有多樣性，可能在內(nèi)吞通路和分泌通路中具有重要的作用，并且是維持惡性瘧原蟲(chóng)生存的重要基因。為了更深入地了解其功能，本文嘗試使用基因敲

3、除和特異性抑制劑等技術(shù)手段，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 首先，構(gòu)建了用于全長(zhǎng)敲除和C端敲除的雙交換敲除載體，經(jīng)電脈沖轉(zhuǎn)染方法，獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。隨后利用有限稀釋法培養(yǎng)了單克隆。遺傳實(shí)驗(yàn)證明沒(méi)有得到預(yù)期的全長(zhǎng)敲除的惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株，但是有發(fā)生單交換的蟲(chóng)體存在。C末端敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子由于時(shí)間關(guān)系，沒(méi)有及時(shí)單克隆化并進(jìn)行分析，對(duì)C末端敲除后的效果尚待觀察。 其次，本研究中嘗試了p.f dynamin like protein1蛋白在原

4、核和真核表達(dá)系統(tǒng)中全長(zhǎng)表達(dá)，試用各種誘導(dǎo)條件均未成功。隨后改用密碼子優(yōu)化法，將p.f dynamin like protein1基因密碼子全部替換成大腸桿菌(E.coli)偏愛(ài)的密碼子，實(shí)現(xiàn)了p.f dynamin like protein1全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)，并證實(shí)其具有GTPase活性，且不受C末端131個(gè)氨基酸缺失的影響。 最后，通過(guò)使用dynamin特異性抑制劑dynasore，發(fā)現(xiàn)dynasore能夠有效地抑制p.f dy

5、namin like protein1的GTPase活性。將dynasore與培養(yǎng)的惡性瘧原蟲(chóng)共孵育，能夠抑制惡性瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)。結(jié)合前期研究結(jié)果與已經(jīng)明確dynamin家族的功能，提出了p.f dynamin like protein1參與瘧原蟲(chóng)血紅蛋白內(nèi)吞的假設(shè)。通過(guò)生物化學(xué)方法顯示，dynasore的使用可以明顯地減少惡性瘧原蟲(chóng)體內(nèi)血紅蛋白的累積以及瘧色素的形成，并能極大減少示蹤劑FITC標(biāo)記的葡聚糖在惡性瘧原蟲(chóng)中的累積，表明dyn

6、asore抑制了p.f dynamin like protein1的GTPase活性，進(jìn)而影響了惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)血紅蛋白的內(nèi)吞作用：電鏡結(jié)果顯示，dynasore處理的惡性瘧原蟲(chóng)體內(nèi)累積了大量的囊泡樣結(jié)構(gòu)，提示dynamin在內(nèi)吞通路中有重要作用。 本研究表明，p.f dynamin like proteinl參與了惡性瘧原蟲(chóng)血紅蛋白內(nèi)吞過(guò)程，并發(fā)揮了重要作用。為揭示惡性瘧原蟲(chóng)的內(nèi)吞機(jī)理提供了新的線索，也為將p.f dynamin