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1、目的:通過構(gòu)建高效表達載體pGEX-NT3的重組質(zhì)粒并在JM109宿主菌中進行表達,希望獲得具有生物活性的人NT3蛋白,為大量獲得重組人NT3純品打下一定的實驗基礎(chǔ).方法:首先通過正常人骨髓獲得全基因組DNA,經(jīng)PCR擴增出NT3全序列;再經(jīng)雙酶切連接到表達載體pGEX-1λT中,構(gòu)建重組載體pGEX-NT3并轉(zhuǎn)化宿主菌JM109.通過酶切和自動化測序鑒定重組質(zhì)粒的正確性.最后經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE凝膠電泳檢測NT3融和蛋白的
2、表達.結(jié)果:通過PCR擴增出NT3外顯子730bpDNA片斷;重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切檢測到與PCR相同大小的DNA片斷;經(jīng)自動化測序除第198位堿基發(fā)生突變,其它序列與文獻報道完全一致.而含重組質(zhì)粒的宿主菌JM109經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE凝膠電泳,顯示有54kD的特異性融合蛋白條帶產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)菌體裂解液沉淀部分NT3融合蛋白含量較高.結(jié)論:成功構(gòu)建了人NT3原核重組表達載體pGEX-NT3,表達出人NT3融合蛋白,為獲得具有生物活性
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