鹽藻DsRab基因的載體構(gòu)建、原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)是一類(lèi)單細(xì)胞海藻,無(wú)細(xì)胞壁,是只有一層膜包被的原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)。鹽藻作為耐鹽模式生物,其短時(shí)間耐鹽方式已有深入了解,主要是離子泵調(diào)節(jié)和甘油合成,但長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫下,相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)及信號(hào)通路被激活的具體過(guò)程仍不清楚。Rab蛋白是小G蛋白家族中最大的亞家族,作為分子開(kāi)關(guān),在細(xì)胞骨架的重組、胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的增值、信號(hào)傳導(dǎo)等重要的細(xì)胞生理活動(dòng)中起關(guān)鍵作用。目前已在多種生物中發(fā)現(xiàn)了耐鹽相關(guān)的Ra

2、b蛋白。研究鹽藻中Rab蛋白,對(duì)揭秘鹽藻應(yīng)答鹽脅迫過(guò)程的分子機(jī)制有重要意義。本實(shí)驗(yàn)的研究方法與結(jié)果如下:
　　1.將DsRab蛋白基因的開(kāi)放閱讀框連接入帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGS-21a,構(gòu)建原核表達(dá)重組載體pGS-21a-DsRab。將DsRab的編碼序列與帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因載體pMDCMGN連接,構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體pMDCGGN。DsRab開(kāi)放閱讀框與植物表達(dá)載體pBI121連接,構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI12

3、1-DsRab。
　　2.將構(gòu)建好的原核表達(dá)重組載體pGS-21a-DsRab導(dǎo)入表達(dá)菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)及表達(dá)形式分析,融合蛋白成功表達(dá)并以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在。對(duì)溫度、誘導(dǎo)劑濃度等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,在28℃,0.01mol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)下,上清中融合蛋白表達(dá)量最大。利用GST標(biāo)簽蛋白純化柱純化上清中融合蛋白。經(jīng)Western blot鑒定該融合蛋白與抗GST的單克隆抗體有特異的免疫原性,初步證明

4、該融合蛋白為GST-DsRab。
　　3.將構(gòu)建成功的亞細(xì)胞定位重組載體pMDCGGN轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性單克隆,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察DsRab瞬時(shí)表達(dá),發(fā)現(xiàn)融合蛋白GFP-DsRab在洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中表達(dá),并且主要分布于膜上。
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了,原核表達(dá)重組載體pGS-21a-DsRab,亞細(xì)胞定位重組載體pMDCGGN和植物表達(dá)重組載體 PBI121-DsRab