杜氏鹽藻PEPC基因的克隆與油菜DGAT基因微藻表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)是一種抗逆性強(qiáng)的單細(xì)胞真核綠藻,能在高達(dá)5 M的鹽溶液中生長(zhǎng)、繁殖。杜氏鹽藻最突出的優(yōu)點(diǎn)在于光合自養(yǎng)生長(zhǎng)、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、抗逆性極佳,可以有效地通過(guò)大規(guī)模開(kāi)放式培養(yǎng)獲得大量藻體,能極大地降低培養(yǎng)成本,因此適合作為高油脂工程藻株的候選藻種。在油脂代謝過(guò)程中有多種酶參與,并且對(duì)油脂合成產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用,而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶正是油脂代謝通路中非常重要的關(guān)鍵酶。磷酸烯醇式丙酮

2、酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)對(duì)油脂合成起到負(fù)調(diào)控作用,通過(guò)催化磷酸烯醇式丙酮酸不可逆反應(yīng)生成草酰乙酸和磷酸,從而使磷酸烯醇式丙酮酸進(jìn)入蛋白質(zhì)合成代謝。因此磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶可以通過(guò)控制蛋白質(zhì)和油脂合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向,從而決定了蛋白質(zhì)/油脂含量比例。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerolacyltransferase,DGAT)對(duì)油脂合成代謝起到正調(diào)控

3、作用,是催化三酰甘油生物合成的最后一步關(guān)鍵酶,在動(dòng)植物中廣泛存在。DGAT1和DGAT2在細(xì)胞合成三酰甘油過(guò)程中的作用類(lèi)似,DGAT1在三酰甘油代謝中具有廣泛的作用,而DGAT2更傾向于特殊脂肪酸的積累,兩者均能執(zhí)行三酰甘油生物合成的最后一步。
　　 目的:為了研究杜氏鹽藻PEPC基因的功能,克隆了杜氏鹽藻PEPC基因的cDNA全長(zhǎng)序列;并且為了研究外源DGAT基因?qū)ξ⒃逵椭x是否有影響,構(gòu)建了SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因DGA

4、T1和DGAT2進(jìn)行表達(dá)的微藻真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了杜氏鹽藻。
　　 方法:根據(jù)NCBI上GenBank中公布的萊茵衣藻、擬南芥、花生等真核生物PEPC基因兩段高度保守的cDNA序列來(lái)設(shè)計(jì)杜氏鹽藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的簡(jiǎn)并引物,通過(guò)RT-PCR的方法來(lái)獲得杜氏鹽藻PEPC基因的部分cDNA片段,并利用RACE技術(shù)首次從杜氏鹽藻中克隆了包含PEPC基因完整編碼區(qū)的cDNA序列。并且通過(guò)NCBI上GenBank中已公布的甘藍(lán)型油菜D

5、GAT1(登錄號(hào)AF164434)和DGAT2(AF155224)的序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR從甘藍(lán)型油菜中擴(kuò)得DGAT1和DGAT2兩個(gè)基因cDNA編碼區(qū)序列,并構(gòu)建SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因DGAT1和DGAT2進(jìn)行表達(dá)的微藻真核表達(dá)載體,通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化杜氏鹽藻,使用草丁膦對(duì)轉(zhuǎn)基因杜氏鹽藻進(jìn)行篩選。
　　 結(jié)果:RT-PCR的方法來(lái)獲得杜氏鹽藻PEPC基因的部分cDNA片段,并利用RACE技術(shù)首次從杜氏鹽藻中克隆了包含P

6、EPC基因完整編碼區(qū)的cDNA序列。杜氏鹽藻的PEPC基因cDNA序列全長(zhǎng)為3523 bp,包括完整的開(kāi)放閱讀框2949 bp,編碼982個(gè)氨基酸,其蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為110560.5。并且克隆了甘藍(lán)型油菜DGAT1和DGAT2基因的cDNA完整編碼區(qū)序列,序列長(zhǎng)度分別為1512 bp和1026 bp。構(gòu)建了SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因DGAT1和DGAT2進(jìn)行表達(dá)的微藻真核表達(dá)載體pSV40DGAT1(2)/CaMVBar,通過(guò)基因