杜氏鹽藻（Dunaliella salina）14-3-3蛋白基因cDNA全長的克隆與序列分析.pdf

1、14-3-3蛋白普遍存在于所有真核生物細胞中，它具有高度保守性，但又是功能復雜的同源或異源二聚體分子。1967年，Moore和Perez首次在牛腦細胞中發(fā)現(xiàn)一種酸性、可溶的異源二聚體蛋白，并根據(jù)它們在DEAE-纖維素色譜上的組分數(shù)以及在淀粉凝膠中的遷移率命名為14-3-3，其大小約為25-32KD，等電點為4-5。現(xiàn)已清楚它廣泛分布于從植物到哺乳類的真核細胞內(nèi)。研究表明，14-3-3蛋白是一個調(diào)節(jié)蛋白家族，與癌基因或原癌基因產(chǎn)物結(jié)合參與

2、細胞信號傳導，并能與許多功能不同的信號蛋白結(jié)合，例如蛋白激酶Raf-1、KSR-1、Bcr、Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶、PKC、蛋白磷酸酶cdc25c、促凋亡蛋白BAD、抗凋亡蛋白A20、跨膜蛋白受體GA等。因此它參與細胞許多重要的生理過程，并在其中起著至關(guān)重要的作用，如細胞信號的轉(zhuǎn)導、細胞周期的調(diào)控、細胞的凋亡、免疫應答、惡性腫瘤的形成等。 因此，無論是對細胞信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)科學、腫瘤發(fā)病機制，還是在植物生理機制及其對外界脅迫的反應

3、，對它的研究都具有重要意義。此外，近來已有研究證實14-3-3蛋白通常具有阻止細胞凋亡的作用，在腫瘤細胞中表達抑制14-3-3與其他蛋白之間相互作用的多肽可以誘導腫瘤細胞凋亡。而干擾14-3-3功能可能引起細胞快速增殖并增強細胞對凋亡的敏感性，由此提高傳統(tǒng)抗癌藥物的療效，靶向14-3-3蛋白也有望為治療腫瘤開辟一個新途徑。 杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)歸屬于綠藻門，綠藻綱，團藻目，杜氏藻科。是一種比較獨特的單細胞

4、綠藻，無細胞壁，含有一個大的“杯狀”葉綠體，能進行光合作用，具有鞭毛，能游動，可在0.05-5Mol/LNaCL培養(yǎng)液中生長，抗逆性極佳，是一種較為理想的抗逆境生存的生物，也是作為遺傳學研究的良好材料。并且用它作為生物反應器生產(chǎn)口服型疫苗或其他藥物，無須純化即可直接服用，大大降低生產(chǎn)成本。 選擇一些具有特征性的生物作為模式生物，研究高等生物復雜生命現(xiàn)象是生命科學研究的一種重要方法。目前已有多種生物被選做模式生物，如果蠅、酵母、線

5、蟲等都是典型的模式生物。藻類生物中萊茵衣藻也是一種很好的模式生物，杜氏鹽藻和衣藻同屬于綠藻門團藻目，親緣關(guān)系相近，并且鹽藻還具有一些獨特的生物學特性。因此以鹽藻作為模式生物來研究14-3-3蛋白的功能及調(diào)控機制可能更具有特點和優(yōu)勢。目前關(guān)于14-3-3蛋白及其基因的研究已在許多生物中開展，但以鹽藻作為材料的還未見報道。本研究旨在克隆鹽藻14-3-3蛋白基因，進而研究其在細胞信號傳導、細胞凋亡等生命現(xiàn)象中的作用機制。也為調(diào)控鹽藻細胞的生長

6、、建立鹽藻生物反應器鑒定了基礎。 本研究首先以簡并引物PCR的方法克隆了杜氏鹽藻14-3-3基因部分cDNA序列。根據(jù)此cDNA片段序列信息，利用RACE(RapidamplificationofcDNAends，cDNA末端快速擴增)法分別向該基因的5'上游和3'下游進行擴增，獲得了杜氏鹽藻14-3-3基因的5'和3'兩端序列。將上述各序列拼接設計引物，RT-PCR得到了杜氏鹽藻14-3-3基因的全長序列。為研究14-3-3蛋

7、白的功能和機制奠定了堅實的基礎。 一、杜氏鹽藻14-3-3基因cDNA片段的克隆與分析1實驗方法利用簡并引物擴增杜氏鹽藻14-3-3基因cDNA片段根據(jù)GenBank上不同物種的14-3-3蛋白氨基酸序列，找出14-3-3蛋白的氨基酸高度保守同時核苷酸簡并程度低的序列設計簡并引物。以杜氏鹽藻總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再以此為模板，PCR擴增14-3-3基因的cDNA片段。RT-PCR產(chǎn)物利用T-A克隆方

8、法，亞克隆到載體pMD18-T上，隨機挑選陽性克隆進行測序。測序結(jié)果與GenBank上其他物種的14-3-3基因序列進行比對分析，并用BLAST進行同源性分析。 2實驗結(jié)果測序結(jié)果分析表明，RT-PCR得到的14-3-3cDNA片段長為531個堿基，由其推導出的氨基酸序列包含177個氨基酸殘基。經(jīng)BLAST分析證明，與數(shù)據(jù)庫中其他物種的14-3-3氨基酸序列有很高的同源性，其中與衣藻的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為94％

9、，與煙草的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為84％，與豌豆的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為84％，擬南芥的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為83％，與西紅柿的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為83％，與人的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為80％，由此可以判斷擴增的片段為杜氏鹽藻14-3-3蛋白cDNA基因部分序列。 二、杜氏鹽藻14-3-3基因全長cDNA序列的克隆及序列分析1實驗方法1.15'RACE

10、的方法擴增14-3-3基因5'上游cDNA片段提取杜氏鹽藻細胞的總RNA，根據(jù)上述簡并引物擴增出的杜氏鹽藻14-3-3基因部分cDNA片段序列信息，利用5'RACE的方法向5'上游區(qū)擴增杜氏鹽藻14-3-3基因的5'cDNA末端片段。本實驗利用5'-fullRACE試劑盒，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物環(huán)化(self-ligation)后，再利用基因特異引物分別進行巢式PCR。擴增結(jié)果即為包含部分已知序列的杜氏鹽藻14-3-3蛋白基因的5'上游未知序列片

11、段。擴增產(chǎn)物亞克隆到載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對經(jīng)過篩選和鑒定正確的質(zhì)粒進行序列分析。 1.23'RACE的方法擴增14-3-3基因3'下游cDNA片段提取杜氏鹽藻細胞的總RNA，根據(jù)上述簡并引物擴增出的杜氏鹽藻14-3-3基因部分cDNA片段序列信息，利用3'RACE的方法向3'下游區(qū)擴增杜氏鹽藻14-3-3基因的3'cDNA末端片段。利用3'-fullRACE試劑盒，用oligodTAdaptorPrim

12、er逆轉(zhuǎn)錄mRNA得到第一條cDNA鏈，然后利用根據(jù)已知序列設計的基因特異引物1和接頭引物進行第一輪PCR擴增，為了增加特異性，再利用基因特異引物2和接頭引物進行第二輪PCR擴增。擴增結(jié)果即為包含部分已知序列的3'端的未知序列片段。擴增產(chǎn)物利用T-A克隆方法，亞克隆到載體pMD18-T上，隨機挑選陽性克隆進行測序。 1.314-3-3基因全長cDNA序列的克隆及序列分析將已經(jīng)得到的14-3-3三段序列拼接，重新設計引物，利用RT

13、-PCR的方法，得到杜氏鹽藻的14-3-3全長cDNA序列。 分別使用Dnaman軟件、Dnasis軟件以及GenBankBLAST檢索分析系統(tǒng)等對所擴增的14-3-3基因全長進行氨基酸和核苷酸序列同源性以及密碼子偏好性等的分析。 2實驗結(jié)果2.15'RACE的方法擴增14-3-3基因5'上游cDNA片段根據(jù)已知的14-3-3部分序列信息，利用5'RACE的方法擴增14-3-3基因的5'上游序列，得到一個約260bp的序

14、列，除去非編碼區(qū)序列，推導出的氨基酸序列共有58個氨基酸殘基。序列中含有起始密碼子ATG。根據(jù)BLAST分析結(jié)果，顯示該氨基酸序列與其它物種14-3-3蛋白基因氨基酸序列有較高的同源性。 2.23'RACE的方法擴增14-3-3基因3'下游cDNA片段根據(jù)已知的14-3-3部分序列信息，利用3'RACE的方法擴增14-3-3基因的3'上游序列，得到一個約750bp的序列，除去非編碼區(qū)序列，推導出的氨基酸序列共有41個氨基酸殘基。

15、序列中含有終止密碼子TAA和poly(A)尾。根據(jù)BLAST分析結(jié)果，顯示該氨基酸序列與其它物種14-3-3蛋白基因氨基酸序列有較高的同源性。 2.314-3-3基因全長cDNA序列的克隆及序列分析測序結(jié)果分析表明，得到了14-3-3蛋白的全長cDNA序列(該序列已在GenBank登錄，基因序列號為：AY965896)。它是一個1485bp的序列，含有一個完整的開放讀碼框，全長編碼區(qū)共774bp，推導的氨基酸序列有258個氨基酸

16、殘基。在將該氨基酸序列與GenBank已知物種的14-3-3氨基酸序列進行BLAST分析、比較后，顯示該氨基酸序列與其它物種14-3-3蛋白基因氨基酸序列有較高的同源性。 三、結(jié)論；1-克隆得到完整的14-3-3cDNA序列，全長1485bp，包含一個完全的開放讀碼框(774bp)，編碼一個全長258個氨基酸的蛋白序列，該序列與Chlamydomonasreinhardtii(衣藻)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為89％

17、，與Nicotianatabacum(煙草)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為81％，Arabidopsisthaliana(擬南芥)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為80％，與tomato(西紅柿)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性為77％，與Homosapiens(人)的14-3-3蛋白基因同源性為80％。 2.對杜氏鹽藻14-3-3密碼子使用偏好性的分析結(jié)果提示，在杜氏鹽藻14-3-3氨基酸序列中，具有兩種