杉木14-3-3蛋白基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、14-3-3蛋白是一類酸性、可溶性蛋白,于1967年Moore和Perez進(jìn)行牛腦組織蛋白分類純化研究中首次被發(fā)現(xiàn)。14-3-3蛋白廣泛存在于真核生物中,是一類功能多樣、基因高度保守,且能在體內(nèi)形成同型或者異型的二聚體分子的蛋白家族。不同物種中的14-3-3蛋白由不同基因編碼,但其氨基酸序列具有高度同源性。14-3-3蛋白廣泛地參與各種生理過程,如在植物基礎(chǔ)代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物中功能基因的轉(zhuǎn)錄、病害和非生物脅迫的抵御及植物生長(zhǎng)發(fā)育的

2、調(diào)控等方面都具有重要作用。因此,14-3-3蛋白受到廣泛關(guān)注并已有多方面的研究,但在杉木中還未見報(bào)道。為此,本研究主要根據(jù)同源物種的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的方法獲得杉木14-3-3蛋白基因的中間片段,用RACE技術(shù)擴(kuò)增5’和3’末端,進(jìn)而拼接得到全長(zhǎng),并通過RT-PCR驗(yàn)證拼接結(jié)果的準(zhǔn)確性;同時(shí)對(duì)4個(gè)杉木14-3-3蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以及在干旱脅迫下基因表達(dá)情況分析,以期探討杉木14-3-3蛋白基因的功能,為發(fā)掘杉木功能基因用于杉木

3、抗逆改良奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.利用同源物種的14-3-3蛋白基因序列,通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的方法獲得了4條杉木14-3-3蛋白基因的部分保守區(qū)域序列,長(zhǎng)度分別為531bp、531bp、533bp和531bp;隨后運(yùn)用RACE技術(shù)對(duì)所獲得的4條保守區(qū)域的5’末端和3’末端進(jìn)行擴(kuò)增;將得到所有的末端序列分別與對(duì)應(yīng)的保守區(qū)域序列進(jìn)行拼接,得到4條長(zhǎng)度分別為1280bp、1225bp、1165bp和1261bp的杉木14-

4、3-3基因cDNA全長(zhǎng)序列,并且將4個(gè)基因暫記為14-3-3-0、14-3-3-1、14-3-3-3和14-3-3-4;在4條杉木14-3-3基因cDNA的開放讀碼框外設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的結(jié)果與拼接結(jié)果一致,為進(jìn)一步的功能分析奠定了基礎(chǔ)。
　　2.運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)所得到的杉木4個(gè)14-3-3基因編碼的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明,4個(gè)14-3-3蛋白均為酸性的、親水性的不穩(wěn)定蛋白;14-3-3-0、14-3-

5、3-1和14-3-3-4這三個(gè)蛋白的分子量比較接近,14-3-3-3蛋白的分子量最大為34.391kDa;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,4個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)都是α螺旋所占的比例最高;生物學(xué)功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,14-3-3-0和14-3-3-4這兩個(gè)蛋白的轉(zhuǎn)錄功能的可能性最大,而14-3-3-1和14-3-3-3這兩個(gè)蛋白的氨基酸生物合成可能性最大;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,14-3-3-0、14-3-3-1和14-3-3-4這3個(gè)蛋白定位在細(xì)胞質(zhì),而14-3

6、-3-3蛋白定位在細(xì)胞外的概率較大;跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,14-3-3-0、14-3-3-1和14-3-3-4這3個(gè)蛋白無跨膜螺旋區(qū),14-3-3-3蛋白有1個(gè)跨膜螺旋區(qū),預(yù)測(cè)其可能是一種跨膜蛋白;三維預(yù)測(cè)結(jié)果表明,只有14-3-3-4蛋白具有由兩個(gè)單體組成C字型鉗狀的兩性凹槽結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象;氨基酸同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示;4個(gè)14-3-3蛋白與7個(gè)近源物種具有相同的保守區(qū)域,而兩端區(qū)域氨基酸序列差異較大;核酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,14-3

7、-3-0、14-3-3-1和14-3-3-3三者的蛋白核酸序列進(jìn)化樹相同,都與白云杉及北美云杉的親緣關(guān)系最近,而14-3-3-4蛋白與番茄的親緣關(guān)系最近。以上結(jié)果是杉木14-3-3蛋白的功能預(yù)測(cè),為杉木14-3-3蛋白家族成員間不同功能的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
　　3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)杉木14-3-3基因在響應(yīng)干旱脅迫后的表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析。熒光定量結(jié)果表明,14-3-3-3可能參與了干旱脅迫應(yīng)答,其余3個(gè)基因