杜氏鹽藻驅(qū)動(dòng)蛋白-2亞基FLA8的基因克隆及功能分析.pdf

1、鞭毛是進(jìn)化上非常保守的具有特殊功能的細(xì)胞器,在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、感知外界環(huán)境信號(hào)并向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的過程中擔(dān)任重要角色,其功能和運(yùn)動(dòng)性的改變可導(dǎo)致多種疾病,如多囊腎、肥胖癥、糖尿病、癌癥等。鞭毛內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和組裝是通過鞭毛內(nèi)運(yùn)輸(Intraflagellax transport,IFT)來調(diào)控的,IFT分為從基體沿著軸絲向鞭毛頂部的正向運(yùn)輸和方向相反的逆向運(yùn)輸,分別由驅(qū)動(dòng)蛋白-2(kinesin-2)和動(dòng)力蛋白(dynein)進(jìn)行。Kinesi

2、n-2是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族中的唯一一個(gè)由異源動(dòng)力亞基組成的復(fù)合物,包括三個(gè)亞基:兩個(gè)不同的動(dòng)力亞基和一個(gè)非動(dòng)力結(jié)合亞基。研究顯示衣藻kinesin-2的一個(gè)動(dòng)力亞基FLA10定位在分裂期的有絲分裂紡錘體中和分裂間期細(xì)胞的鞭毛軸絲外層微管和鞭毛膜之間,FLA10基因的突變可以使鞭毛重吸收受到阻礙,衣藻kinesin-2的另一個(gè)動(dòng)力亞基FLA8與染色體缺失相關(guān),但FLA8對(duì)鞭毛再生過程的影響未見報(bào)道。
　　 杜氏鹽藻(Dunaliell

3、a salina,D.salina)是一種無細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核綠藻,具有一對(duì)等長(zhǎng)的鞭毛,長(zhǎng)約13μm,具有典型的9+2結(jié)構(gòu)。顯微鏡下即可觀察到其鞭毛長(zhǎng)度和運(yùn)動(dòng)性的變化。本實(shí)驗(yàn)以杜氏鹽藻為模式生物,以其鞭毛為研究對(duì)象,觀察杜氏鹽藻FLA8在鞭毛再生過程中的作用,為進(jìn)一步研究FLA8在鞭毛組裝過程中的作用及鞭毛內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制提供依據(jù)。
　　 本研究根據(jù)團(tuán)藻、衣藻和小球藻等的FLA8蛋白的氨基酸保守序列GYNGTIF和NEDPKDA設(shè)計(jì)簡(jiǎn)

4、并引物,采用。RT-PCR、3'和5'RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得杜氏鹽藻FLA8基因的cDNA全長(zhǎng)序列。然后用機(jī)械法脫去杜氏鹽藻鞭毛,在鞭毛再生過程中分別收集各時(shí)期的藻體,提取細(xì)胞總RNA,并反轉(zhuǎn)錄得到各時(shí)期的cDNA,通過Primer Premier6.0在FLA8結(jié)構(gòu)域中設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,通過熒光定量PCR分析FLA8基因在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中的作用。
　　 克隆得到的杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長(zhǎng)序列為2612 bp,序列

5、分析顯示其包括90 bp的5'UTR、167 bp的3'UTR以及2355 bp的開放閱讀框,編碼784個(gè)氨基酸殘基,其蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為6.65,分子量為85.097 kDa。氨基酸序列同源性分析顯示其與其他物種有較高的同源性:團(tuán)藻(73％)、衣藻(72％)、小球藻(53％)等,說明克隆所得的序列為杜氏鹽藻FLA8的基因序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示杜氏鹽藻FLA8 mRNA水平在鞭毛再生過程中持續(xù)高表達(dá),在鞭毛再生速度較快的前3