鹽生杜氏藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因的克隆、表達(dá)以及功能鑒定.pdf

1、線粒體3-磷酸甘油脫氫酶(FAD-GPDH)是由核基因編碼的蛋白，位于線粒體內(nèi)膜的外表面，催化位點(diǎn)朝向細(xì)胞質(zhì)，以3-磷酸甘油為底物，并通過(guò)其輔基FAD與呼吸鏈相連。它與細(xì)胞質(zhì)3-磷酸甘油脫氫酶(NAD<'+>-GPDH)一起組成3-磷酸甘油穿梭(glycerol-3-phosphate shuttle)，在該穿梭中，細(xì)胞質(zhì)3-磷酸甘油脫氫酶把NADH氧化成NAD<'+>，同時(shí)還原糖酵解途徑的中間代謝物——磷酸二羥基丙酮為3-磷酸甘油；隨

2、后，3-磷酸甘油穿過(guò)線粒體外膜，在內(nèi)膜的外表面被線粒體3-磷酸甘油脫氫酶重新氧化成磷酸二羥基丙酮，脫下的兩個(gè)電子由線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的輔基：FAD傳給輔酶O，進(jìn)入呼吸鏈傳遞，產(chǎn)生能量以供細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝需要。氧化生成的磷酸二羥基丙酮重新回到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行下一輪循環(huán)或回到糖酵解途徑。因此，3-磷酸甘油穿梭的實(shí)質(zhì)就是把細(xì)胞質(zhì)中NADH上的電子傳到呼吸鏈，從而維持細(xì)胞質(zhì)的氧化還原平衡。 3-磷酸甘油穿梭普遍存在于真核生物中。在酵母和

3、動(dòng)物中3-磷酸甘油穿梭早有報(bào)道，且已有較深入的研究；但是直到最近才在擬南芥中發(fā)現(xiàn)線粒體3-磷酸甘油脫氫酶，并通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明植物中也存在3-磷酸甘油穿梭，除此之外再?zèng)]有其它關(guān)于植物3-磷酸甘油穿梭的報(bào)道；至今未見(jiàn)任何有關(guān)藻類3-磷酸甘油穿梭的報(bào)道。 鹽生杜氏藻(Dunaliella salina，鹽藻)是一種單細(xì)胞綠藻，能在很大鹽濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，沒(méi)有細(xì)胞壁，通過(guò)細(xì)胞膜伸縮改變細(xì)胞體積和調(diào)整細(xì)胞中的甘油濃度來(lái)適應(yīng)不同的滲透環(huán)境。

4、線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的底物——3-磷酸甘油，既是甘油合成的前體，同時(shí)也是合成細(xì)胞中甘油脂(包括膜脂和貯藏脂)必不可少的前體物質(zhì)，所以研究鹽藻細(xì)胞中3．磷酸甘油的代謝有利于更好地了解鹽藻適應(yīng)高滲環(huán)境的內(nèi)在機(jī)制。因?yàn)樯矬w細(xì)胞在脅迫條件下，往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD<'+>比例的失衡，即氧化還原狀態(tài)的失衡，所以對(duì)鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的功能和特性進(jìn)行研究，可以為進(jìn)一步窺探鹽藻細(xì)胞的3-磷酸甘油穿梭及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞中氧化還原平衡

5、所發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。本論文的內(nèi)容包括鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶全長(zhǎng)cDNA的克隆、對(duì)編碼框蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析、進(jìn)行原核表達(dá)及體外功能鑒定、在轉(zhuǎn)錄和酶活水平上進(jìn)行表達(dá)分析。取得成果具體如下： 1、克隆了鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因全長(zhǎng)cDNA：在鹽藻cDNA文庫(kù)中篩選獲得線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因EST序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3’RACE和5’RACE，獲得了包括編碼框序列、3’端非編碼區(qū)及5’端非編碼區(qū)的線粒體3-

6、磷酸甘油脫氫酶基因全長(zhǎng)cDNA序列。 2、完成鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因編碼框蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析：信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)其N端具有導(dǎo)向線粒體的前導(dǎo)肽序列；跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)氨基酸序列中有3個(gè)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域；把它與其它物種的線粒體3-磷酸甘油脫氫酶進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在保守區(qū)域具有FAD結(jié)合位點(diǎn)和3-磷酸甘油結(jié)合位點(diǎn)。 3、進(jìn)行鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基因的原核表達(dá)及體外酶活測(cè)定：把鹽藻線粒體3-磷酸甘油脫氫酶基