水稻紋枯病菌三磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆及其遺傳轉化體系的構建.pdf

1、由立枯絲核菌(Rhizoctonia Solani)引起的水稻紋枯病是世界性的水稻三大病害之一,幾乎所有的稻田都會發(fā)生紋枯病,全世界平均每年因該病造成的損失稻谷達數(shù)十億公斤。因此,對水稻紋枯病菌的研究具有非常重要的科學和實際意義。由于缺乏有效的遺傳轉化系統(tǒng),對該病的研究主要集中在病菌的分類、抗性機制、病害流行與防治等研究。
　　 關于水稻紋枯病菌的遺傳轉化,國外已有了一些報道,國內則報道甚少。對于立枯絲核菌的轉化效率,相關報道顯

2、示也是比較低,采用合適的啟動子,是能否進行高效轉化的關鍵因素之一,因此尋找水稻紋枯病菌高效啟動子是提高其轉化效率的一種途徑。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GPD)在真核細胞中高效表達,如在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)其含量可達細胞內可溶蛋白的5％；在面包酵母中其mRNA的量占總mRNA量的2～5％。因此,GPD基因的啟動子可能為一

3、強啟動子。而且在許多不同的真菌中,GPD基因啟動子已經被成功地用來構建轉化體系。
　　 本研究利用同源克隆及染色體步移策略,從水稻紋枯病菌基因組獲得4613bp片段,NCBI序列同源分析該片段包含了GPD基因,暫命名為RsGPD,預測其全長為1531bp。通過RT-PCR擴增其CDS序列,分析顯示其擁有10個內含子。Southern雜交結果顯示,RsGPD在水稻紋枯病菌基因組中以單拷貝形式存在。RsGPD編碼343個氨基酸的蛋白

4、。蛋白序列同源性分析,RsGPD基因氨基酸同源性與立枯絲核菌國際標準融合群AG-3最高,達85.52％。此外,在不同融合群的立枯絲核菌中內含子的分布及大小具有高度相似性。
　　 根據(jù)RsGPD基因設計引物,擴增水稻紋枯病菌的GPD啟動子。通過TFSEARCH軟件對GPD啟動子片段進行分析,結果表明此序列含有TATA-box、CAAT-box、G-box、SP1-box及CT rich-motif等順式作用元件。采用PlantCA

5、RE數(shù)據(jù)庫及TFSitescan service軟件分析GPD啟動子片段,結果表明,該片段含有多個轉錄因子如 ADR1、GATA-box、CCAAT-box、StuA-type、GCR1及GCN4等結合位點。
　　 以pCAMBIA1300X質粒為骨架,構建3個以水稻紋枯病菌GPD啟動子啟動潮霉素抗性基因的表達載體,其中2個載體的潮霉素基因做了如下改進,通過Over-lap PCR將潮霉素基因的5’端的160bp-195bp區(qū)間

6、的AT轉變?yōu)镚C或在潮霉素基因兩端添加水稻紋枯病菌的漆酶(Z54277)內含子。利用上述質粒,進行農桿菌介導轉化水稻紋枯病菌菌絲體及菌絲球。最終在農桿菌介導轉化水稻紋枯病菌菌絲球中,獲得了轉化子。然而這些轉化子在繼代培養(yǎng)中,潮霉素抗性性狀,出現(xiàn)了丟失的現(xiàn)象。表型分析表明,這些轉化子為非整合轉化(Transienttransformation)即DNA未整合至染色體上,而是游離在基因組之外,因而在生長或繼代的過程中丟失。此外,轉化子獲得數(shù)