捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA疫苗的免疫保護(hù)作用與烯醇化酶特性的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲，分布較廣，寄生于反芻動(dòng)物第四胃，偶見(jiàn)于小腸，因吸血常常導(dǎo)致貧血、消瘦、嚴(yán)重時(shí)甚至死亡，對(duì)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失．目前防治該病方法主要是化學(xué)藥物驅(qū)蟲，但由于蟲體抗藥性的產(chǎn)生以及藥物殘留和藥物污染等問(wèn)題，迫使人們將注意力轉(zhuǎn)移到利用免疫學(xué)方法來(lái)防治該病．
　　 本文進(jìn)行了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷

2、酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，HcGAPDH）特性研究及其疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)；同時(shí)對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶（Enolase，HcENO）進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，克隆得到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸甘油酸激酶基因序列并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，主要工作如下：1．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶特性的研究
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛3磷酸脫氫酶基因EST序列（登錄號(hào)

3、為AW670737，登錄長(zhǎng)度為362bp）設(shè)計(jì)基因特異性引物，分別利用5'RACE和3'RACE獲得該基因5，端未知區(qū)和3，端未知區(qū)，從而拼接得到HcGAPDH基因的全長(zhǎng)eDNA，然后將該序列遞交GenBank（登錄號(hào)為HM145749）．后經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：該基因全長(zhǎng)1303bp，含有最大開放閱讀框(ORF)為1026bp，5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)長(zhǎng)90 bp，3啡翻譯區(qū)（3'-UTR）長(zhǎng)175bp．根據(jù)此基因的全長(zhǎng)cDNA設(shè)計(jì)l對(duì)特異

4、性引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出約1000bp的產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果與推導(dǎo)出的ORF序列一致．BLAST分析后將該片段克隆到pET-28a(+)載體中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白．SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)，分子量約38kDa．以自然感染的山羊血清作為一抗，Western blot分析結(jié)果顯示在38kDa處出現(xiàn)特異性條帶．用HcGAPD

5、H表達(dá)蛋白的包涵體免疫大鼠制備高免血清做一抗，Western blot分析HcGAPDH基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的天然表達(dá)，結(jié)果在38kD處有明顯條帶，與推測(cè)ORF的蛋白大小無(wú)明顯區(qū)別．酶活性測(cè)定結(jié)果表明該重組蛋白具有一定的甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化活性，其最適pH值為8，最適反應(yīng)溫度為40℃．
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-酸脫氫酶蟲體組織分布的研究
　　 為了研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyeeralde

6、hyde-3-phosphatedehydrogenase，HcGAPDH)在蟲體中的分布與定位情況，我們應(yīng)用常規(guī)方法表達(dá)已構(gòu)建好的pET28a-HcGAPDH，GE純化柱純化后，免疫SD大鼠制備抗血清．濃縮型S-P免疫組化3步法檢測(cè)HcGAPDH抗原在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)的分布和表達(dá)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HcGAPDH主要定位于小腸微絨毛上皮，在其他部位則鮮見(jiàn)．
　　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲pVAXI-HcGAPDH DNA疫苗的構(gòu)建與體內(nèi)表達(dá)情

7、況的檢測(cè)
　　 利用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建pVAXl-HcGAPDH DNA疫苗．經(jīng)酶切鑒定后，腿部肌肉免疫小鼠，l周后取肌肉注射部位、非注射部位組織，利用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)DNA疫苗的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況．RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠注射部位肌肉所擴(kuò)增出的目的條帶大小約為1000bp，非注射部位中未能檢測(cè)到目的條帶，從而說(shuō)明重組質(zhì)粒在注射部位可以成功轉(zhuǎn)錄；Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射部

8、位檢測(cè)到大小為38kD的目的蛋白條帶，而非注射部位未能檢測(cè)到目的蛋白的條帶，這些結(jié)果都為下一步的動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)．
　　 4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲pVAXI-HcGAPDH DNA疫苗的免疫保護(hù)性試驗(yàn)
　　 使用DNA疫苗pVAXl-HcGAPDH，對(duì)9-10月齡山羊做了免疫保護(hù)性試驗(yàn)．健康山羊15只，隨機(jī)分成3組，每組5只．一組免疫100μg pVAXI-HcGAPDH，其他兩組為不攻蟲對(duì)照組和攻蟲對(duì)照組．在試驗(yàn)山羊的

9、背部皮下多點(diǎn)注射免疫，兩個(gè)對(duì)照組用lml PBS代替DNA疫苗，一共免疫兩次，中間間隔2周，第二次免疫14天后，疫苗免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊口腔接種5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期感染性幼蟲．從攻蟲后22至34天，每隔一天收集糞便，蟲卵計(jì)數(shù)，攻蟲后35天，屠宰山羊并剖解皺胃，分離雌雄蟲體，進(jìn)行成蟲計(jì)數(shù)，同時(shí)，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，測(cè)定了所有試驗(yàn)山羊血清特異性IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜組織勻漿中特異性IgA濃度

10、．在免疫前、首免后14d、二免后14d、攻蟲后14d和殺羊前對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)：利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清細(xì)胞因子（IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22）的濃度變化；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了所有試驗(yàn)山羊外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的變化；利用全自動(dòng)電子血細(xì)胞分析儀對(duì)所有試驗(yàn)山羊的外周血中嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血紅蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，DNA疫苗pVAXI-HcGAPD

11、H免疫山羊后，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明血清IgG在首免后14天達(dá)到較高水平，二免后抗體水平進(jìn)一步升高；血清IgA在免疫后出現(xiàn)較高水平的滴度，同時(shí)殺羊后發(fā)現(xiàn)胃粘膜組織勻漿具有較高的滴度，免疫后山羊CD4+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞因子檢測(cè)免疫組K,-4水平上升顯著，IFN-γ、TGF-β、IL-22變化規(guī)律性不明顯．分析試驗(yàn)山羊血細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊嗜酸性粒細(xì)胞濃度顯著高于不攻蟲對(duì)照組．5000條捻

12、轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲攻擊試驗(yàn)山羊后，免疫組蟲卵減少率為34.9％，雌蟲、雄蟲和成蟲總數(shù)減少率分別為39.23%，36.03%和37.73%，說(shuō)明pVAXI-HcGAPDH對(duì)抵御山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染具有一定效果．
　　 5.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶特性的研究
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶（Enolase）基因EST序列（登錄號(hào)為BF422728，登錄長(zhǎng)度為482bp）設(shè)計(jì)基因特異性引物，分別利用5’RA

13、CE和3’RACE獲得該基因5'端未知區(qū)和3’端未知區(qū)，從而拼接得到Enolase基因的全長(zhǎng)cDNA．分析發(fā)現(xiàn)：該基因全長(zhǎng)1583bp，含有最大開放閱讀框（ORF）為1305bp，5’非翻譯區(qū)(5'-UTR)長(zhǎng)62 bp，3'啡翻譯區(qū)(3’-UTR)長(zhǎng)216bp．根據(jù)Enolase基因的全長(zhǎng)cDNA設(shè)計(jì)l對(duì)特異性引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出約1300bp的產(chǎn)物，將該片段克隆到pET-28a(+)載體

14、中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)．SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)，分子量約49kDa．以自然感染的山羊血清作為一抗，Western blot結(jié)果顯示在49kDa處出現(xiàn)特異性條帶．HcGAPDH表達(dá)蛋白的包涵體免疫大鼠制備高免血清做一抗，用Western blot分析HcGAPDH基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的天然表達(dá)，結(jié)果在49kDa處有明顯條帶，與推測(cè)ORF的蛋白大小近似．酶活性測(cè)定結(jié)果表明該重組

15、蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性，其最適pH值為7．
　　 6.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸甘油酸激酶的生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲磷酸甘油酸激酶(Phosphoglyccrate kinase,HcPGK)基因EST序列（登錄號(hào)為CB192372，登錄長(zhǎng)度為584bp）設(shè)計(jì)基因特異性引物，分別利用5'ACE和3'ACE獲得該基因5'端未知序列和3'端未知序列，從而拼接得到PGK基因的全長(zhǎng)cDNA．利用