3-磷酸甘油醛脫氫酶胞漿聚集及核轉(zhuǎn)位在帕金森病發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞帕金森病模型的建立
　　第一節(jié) 魚(yú)藤酮對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞的影響
　　目的：研究魚(yú)藤酮對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SH-SY5Y的影響。
　　方法：觀察魚(yú)藤酮處理后 SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化,采用MTT比色法檢測(cè)魚(yú)藤酮處理對(duì)細(xì)胞活力的影響,選定魚(yú)藤酮干預(yù)濃度;采用吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡方式并

2、計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：魚(yú)藤酮處理后 SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)改變明顯,生長(zhǎng)受到抑制,神經(jīng)元突起變短減少,部分細(xì)胞圓縮,細(xì)胞貼壁能力降低;MTT結(jié)果提示,魚(yú)藤酮可濃度依賴性和時(shí)間依賴性的降低 SH-SY5Y細(xì)胞活力;AO/EB雙熒光染色顯示,魚(yú)藤酮誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞的死亡方式以凋亡為主,并時(shí)間依賴性和濃度依賴性誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：魚(yú)藤酮能夠時(shí)間依賴性和濃度依賴性誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。
　　第二節(jié) 魚(yú)

3、藤酮誘導(dǎo)未分化 SH-SY5Y細(xì)胞 PD模型的建立
　　目的：觀察魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)包涵體的形成及α-突觸核蛋白的表達(dá)和定位改變。
　　方法：HE染色觀察魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24h和48h后細(xì)胞形態(tài)變化及包涵體形成;激光共聚焦熒光顯微鏡觀察魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后α-突觸核蛋白(α-synuclein)的分布和性狀改變;蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測(cè)魚(yú)藤酮對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-synucl

4、ein蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：HE染色,光鏡下見(jiàn)魚(yú)藤酮處理后 SH-SY5Y細(xì)胞胞體和胞核明顯增大,突起變短減少,胞質(zhì)疏松、空泡化,出現(xiàn)核固縮,胞漿內(nèi)觀察到嗜伊紅、邊界清楚的類路易小體樣包涵體;α-synuclein和Thioflavin S雙熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀α-synuclein免疫染色陽(yáng)性聚集體,可被 Thioflavin S共定位;Western blot檢測(cè)到魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)α

5、-synuclein表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞后出現(xiàn)嗜酸性包涵體,α-synuclein和Thioflavin S共免疫染色陽(yáng)性聚集體,及誘發(fā)α-synuclein蛋白表達(dá)升高,提示魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞能夠很好模擬 PD病理特征,能夠作為神經(jīng)毒素成功建立 PD細(xì)胞模型。
　　第二部分 魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞 PD模型中GAPDH表達(dá)、分布的變化
　　第一節(jié) 魚(yú)藤酮對(duì) SH-S

6、Y5Y細(xì)胞中GAPDH表達(dá)、亞細(xì)胞定位的影響
　　目的：研究魚(yú)藤酮對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi) GAPDH的表達(dá)、亞細(xì)胞定位的影響。
　　方法：使用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi) GAPDH的分布和亞細(xì)胞定位改變;采用蛋白免疫印跡分析(Western blot)和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)魚(yú)藤酮對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi) GAPDH蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：免疫染色激光

7、共聚焦結(jié)果顯示,魚(yú)藤酮處理后,SH-SY5Y細(xì)胞胞漿內(nèi) GAPDH染色熒光增強(qiáng),且出現(xiàn) GAPDH染色陽(yáng)性顆粒樣聚集體,部分細(xì)胞胞核內(nèi) GAPDH分布增多。而正常組 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi) GAPDH蛋白在胞漿中均勻分布,胞核內(nèi)僅有少量分布。Western blot及real-time PCR結(jié)果分析顯示,魚(yú)藤酮處理后細(xì)胞內(nèi) GAPDH蛋白和mRNA水平隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。
　　結(jié)論：PD細(xì)胞模型中,魚(yú)藤酮可以導(dǎo)致 GAPDH

8、亞細(xì)胞定位及性狀改變,誘發(fā)GAPDH的過(guò)表達(dá)和異常聚集,這可能是神經(jīng)元凋亡及包涵體形成的重要機(jī)制之一。
　　第二節(jié) 魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后 SH-SY5Y細(xì)胞核中GAPDH定位及表達(dá)變化
　　目的：探討魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y后胞核內(nèi) GAPDH定位及表達(dá)變化。
　　方法：魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞后免疫熒光染色,使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi) GAPDH的表達(dá)和定位改變;同時(shí)采用免疫組織化學(xué)染色觀察魚(yú)藤酮誘導(dǎo)對(duì)GAPDH

9、的影響;提取細(xì)胞核蛋白,采用蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi) GAPDH的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：免疫熒光激光共聚焦結(jié)果顯示,正常細(xì)胞內(nèi) GAPDH蛋白均勻分布于細(xì)胞漿,胞核區(qū)僅有少量分布,魚(yú)藤酮處理48h后,部分細(xì)胞的胞核區(qū) GAPDH熒光染色增強(qiáng)、濃聚。免疫組化染色光鏡下觀察到魚(yú)藤酮處理后細(xì)胞 GAPDH染色增強(qiáng),部分細(xì)胞核呈濃染棕色,與免疫熒光染色結(jié)果一致。Western blot結(jié)果也顯示,隨著魚(yú)藤酮

10、處理濃度增大細(xì)胞核內(nèi) GAPDH的表達(dá)量逐漸升高,呈濃度依賴性。以上結(jié)果提示 GAPDH發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：魚(yú)藤酮可以導(dǎo)致 GAPDH發(fā)生核轉(zhuǎn)位,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)和處理濃度增大, GAPDH的核轉(zhuǎn)位增加,提示 GAPDH核轉(zhuǎn)位可能是魚(yú)藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制。
　　第三部分 GAPDH胞漿聚集和核轉(zhuǎn)位在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中的作用機(jī)制
　　第一節(jié) GAPDH異常降解對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后 SH-SY5Y細(xì)胞的影響

11、
　　目的：探討泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑在 GAPDH蛋白降解中的作用。
　　方法：采用MTT比色法檢測(cè)不同藥物(魚(yú)藤酮、MG132、3-MA、Rapamycin和MgCl2)干預(yù)對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響,選擇藥物干預(yù)濃度;通過(guò)選擇性抑制和激活泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑兩條降解通路,采用蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測(cè)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi) GAPDH蛋白水平變化。
　　結(jié)果：魚(yú)藤酮處

12、理后細(xì)胞內(nèi) GAPDH蛋白水平上調(diào),加入蛋白酶體抑制劑 MG132和自噬溶酶體途徑抑制劑3-MA后細(xì)胞內(nèi) GAPDH上升更明顯,與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05),說(shuō)明兩條途徑被抑制后增加了細(xì)胞內(nèi) GAPDH的含量;加入蛋白酶體促進(jìn)劑 Mg2+和溶酶體途徑激活劑 Rapamycin后細(xì)胞內(nèi) GAPDH水平下調(diào),低于單獨(dú)魚(yú)藤酮處理組,Mg2+組 GAPDH下降更明顯,與單獨(dú)魚(yú)藤酮處理組比較差異顯著(P<0.05),說(shuō)明兩條途徑被激活均可

13、減少細(xì)胞內(nèi) GAPDH的含量。
　　結(jié)論：GAPDH不僅通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解,也通過(guò)自噬溶酶體途徑降解。其中泛素蛋白酶體途徑可能在 GAPDH的降解中起更重要的作用。激活兩條降解通路能夠下調(diào) GAPDH,可能為神經(jīng)保護(hù)和PD治療提供新的方向和靶點(diǎn)。
　　第二節(jié) Siah1參與魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位及其下游機(jī)制
　　目的：探討 Siah1在 GAPDH核轉(zhuǎn)位中的作用及其促凋亡作用。
　　方法：采用免疫熒光

14、染色激光共聚焦顯微鏡觀察魚(yú)藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)GAPDH和Siah1的表達(dá)和定位改變;使用蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi) Siah1的表達(dá)變化,分析其與 GAPDH核轉(zhuǎn)位的相關(guān)性。采用Western blot檢測(cè)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的促凋亡作用。
　　結(jié)果：魚(yú)藤酮處理組細(xì)胞的胞漿和胞核中GAPDH和Siah1的熒光強(qiáng)度均較對(duì)照組增強(qiáng),兩者共聚焦后胞漿呈明亮黃色,胞核中也出現(xiàn)黃色熒光。W

15、estern blot結(jié)果也顯示魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后胞核中Siah1表達(dá)呈濃度依賴性增加,與 GAPDH變化趨勢(shì)一致。魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后凋亡相關(guān)蛋白總 p53和線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白 Bax也呈濃度依賴性升高。
　　結(jié)論：Siah1參與了魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位,兩者可能在胞漿中結(jié)合,由胞漿向胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位,發(fā)揮促凋亡作用。
　　第三節(jié) RNA干擾 Siah1表達(dá)對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后 GAPDH核轉(zhuǎn)位的影響
　　目的：研究 RNA干擾對(duì)

16、 Siah1的表達(dá)以及對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位的影響。
　　方法：使用脂質(zhì)體 Lipofectamine2000將針對(duì) Siah1基因的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入 SH-SY5Y細(xì)胞中,使用蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定干擾效果;魚(yú)藤酮處理未干擾組和干擾組 SH-SY5Y細(xì)胞,提取細(xì)胞核蛋白,采用Western blot檢測(cè)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)后未干擾組和干擾組細(xì)胞核內(nèi) GAPDH的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：蛋白免疫印跡結(jié)果