磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原表達(dá)的影響.pdf

1、對(duì)大多數(shù)在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的病毒來(lái)說(shuō)，病毒RNA輸出（RNAexport）是其基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要步驟之一。1993年在HBV基因組上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)片段（1151nt-1684nt）被定義為乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件PRE（HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE）?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為其具有輔助轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核向細(xì)胞漿運(yùn)輸?shù)墓δ?，但機(jī)制尚未清楚。Zang等人用帶電泳遷移率變動(dòng)分析（EM

2、SA）發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞蛋白能夠與HPRE相互作用，其中一個(gè)35kDa的蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。但GAPDH如何影響HBV的復(fù)制和表達(dá)，目前還沒(méi)有具體報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于從體外驗(yàn)證GAPDH與HPRE-RNA的結(jié)合作用，利用檢測(cè)系統(tǒng)pDM138-HPRE探討GAPDH在HPRE轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用，然后過(guò)量表達(dá)GAPDH于HepG22.2.15細(xì)胞和瞬時(shí)表達(dá)HBs的細(xì)胞中，檢測(cè)HBs表達(dá)量來(lái)闡明GAPDH在HBV的轉(zhuǎn)錄后

3、調(diào)節(jié)機(jī)制中的功能。 主要研究方法和研究結(jié)果： 1.用線(xiàn)性化pGEM-HPRE質(zhì)粒作為模板，在Biotion標(biāo)記的堿基體系中用T7RNA聚合酶，以體外轉(zhuǎn)錄的方法合成HPRE-BiotinRNA。在BL21（DE3）細(xì)菌里誘導(dǎo)大量表達(dá)重組體pET32a（+）-GAPDH的GAPDH-His蛋白，獲得大量56KDa的蛋白，再采用Ni2+-NTA樹(shù)脂親和純化，以SDS-PAGE進(jìn)行初步鑒定，并以兔抗人GAPDH和抗His標(biāo)簽抗體

4、來(lái)進(jìn)行Westernblot蛋白鑒定。 2.利用M-280Streptavidin磁珠和Biotin的特異性結(jié)合，可用磁力座分離復(fù)合物的特性，將洗滌后的沉淀復(fù)合物做WesternBlot鑒定。用抗His和抗GAPDH單克隆抗體檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組GAPDH-His+HPRE-BiotinRNA能形成復(fù)合物，可鑒定出目的蛋白條帶，而對(duì)照組His+HPRE-BiotinRNA則沒(méi)有條帶出現(xiàn)。由此證明GAPDH-His蛋白能夠與HPRERNA

5、結(jié)合。 3.將表達(dá)人類(lèi)GAPDH基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-GAPDH，與含CAT報(bào)告基因的pDM138及pDM138-HPRE和表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的pEGFP-N1分組共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定pEGFP-N1表達(dá)的GFP，來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。用ELISA方法檢測(cè)報(bào)告基因CAT的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證蛋白GAPDH對(duì)HPRE功能的影響。報(bào)告基因CAT表達(dá)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDM138-

6、HPRE的細(xì)胞CAT表達(dá)明顯增加；而共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDM138-HPRE和pcDNA3.1（+）-GAPDH，CAT的表達(dá)受到明顯抑制（p<0.05）。 4.將GAPDH蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-GAPDH轉(zhuǎn)染于HepG22.2.15細(xì)胞和瞬時(shí)表達(dá)HBs的293T細(xì)胞中，通過(guò)ELISA檢測(cè)HBs的表達(dá)量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：GAPDH蛋白在HepG22.2.15中過(guò)度表達(dá)對(duì)HBs的表達(dá)有明顯的抑制作用（p<0.05）