三磷酸甘油脫氫酶基因和甘油代謝對(duì)擬南芥種子含油量與根系發(fā)育的影響.pdf

1、種子含油量是油料作物研究的主要性狀之一。三酰甘油是油料作物種子中貯藏性油脂的主要形式。三酰甘油由三磷酸甘油作為骨架逐步與三個(gè)脂肪酸分子結(jié)合而成。前人對(duì)含油量的調(diào)控研究主要集中在參與脂肪酸合成與利用途徑中的有關(guān)基因，而很少有三磷酸甘油對(duì)種子油份積累的報(bào)道。三磷酸甘油在植物細(xì)胞中主要由兩條路徑產(chǎn)生，其一，甘油激酶磷酸化甘油產(chǎn)生三磷酸甘油;其二，三磷酸甘油脫氫酶將磷酸二羥丙酮加氫還原生成三磷酸甘油。近期研究表明，在種子中過(guò)表達(dá)酵母三磷酸甘油脫

2、氫酶基因能提高油菜種子含油量。甘油廣泛存在于微生物，動(dòng)物和植物中。甘油代謝有關(guān)機(jī)制相對(duì)保守，其在微生物和藻類(lèi)等已有較多報(bào)道，但在高等植物中有關(guān)甘油代謝對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響的報(bào)道較少。根系是高等植物的重要器官，也是植物發(fā)育生物學(xué)研究的模式器官之一。利用擬南芥研究甘油對(duì)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育將有助于甘油代謝機(jī)理的全面認(rèn)識(shí)。
　　本研究包括兩方面的內(nèi)容:第一部分是過(guò)表達(dá)甘藍(lán)型油菜三磷酸甘油脫氫酶基因?qū)ΨN子油份積累等性狀的影響;第二部分是利用甘油

3、代謝相關(guān)突變體與三磷酸甘油脫氫酶過(guò)表達(dá)材料比較外源甘油對(duì)擬南芥根系發(fā)育的影響，主要結(jié)果如下:
　　1、利用同源基因克隆法獲得了甘藍(lán)型油菜兩個(gè)GPDH基因。SouthernBlot分析油菜BnGPHp1克隆片段在甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜中的基因拷貝數(shù)分別為2個(gè)、2個(gè)和4個(gè)。氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，BnGPDHs含有三磷酸甘油脫氫酶兩個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，且與甘藍(lán)、白菜及擬南芥GPDHs基因氨基酸序列有高度同源性。生物信息軟件預(yù)測(cè)克隆片段BnGP

4、DHp1與BnGPDHc1分別定位于質(zhì)體與胞質(zhì)中。
　　2、基因表達(dá)分析顯示BnGPDHs在花、蕾中表達(dá)量較高，在根和莖中表達(dá)量較低，在發(fā)育的種子中均有表達(dá)。過(guò)表達(dá)BnGPDHp1轉(zhuǎn)化大腸桿菌甘油營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株后重組菌系能在缺甘油的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
　　3、構(gòu)建BnGPDHs過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)化家系進(jìn)行插入拷貝數(shù)分析與目的基因表達(dá)分析，選取其中5個(gè)家系進(jìn)行表型分析。發(fā)現(xiàn)多數(shù)過(guò)表達(dá)家系在種子重量、種子含油量同野生型

5、比較時(shí)增加差異并不明顯。構(gòu)建Dsred-BnGPDHp1種子特異性過(guò)表達(dá)建構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥，選取轉(zhuǎn)基因后代陽(yáng)性和非陽(yáng)性種子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)家系在種子重量、種子含油量同非陽(yáng)性對(duì)照比較無(wú)明顯差異。對(duì)過(guò)表達(dá)家系與對(duì)照在不同脅迫條件下處理后的鮮重和種子萌發(fā)率進(jìn)行比較，顯示過(guò)表達(dá)BnGPDHp1增強(qiáng)了植物抗鹽脅迫能力。
　　4、鑒定了兩個(gè)甘油代謝有關(guān)純合突變體gpdhp1，gpdhc1，并利用這些突變體獲得了雙突變體gpdhc1gpdhp1

6、。RNA表達(dá)分析顯示目的基因在相應(yīng)材料中均被敲除。種子重量比較發(fā)現(xiàn)，突變體gpdhc1比野生型要高，gpdhp1與野生型差異不顯著，雙突變體gpdhc1gpdhp1顯著下降。種子含油量比較發(fā)現(xiàn)，突變體gpdhp1比野生型要高，gpdhc1與野生型差異不顯著，雙突變體gpdhc1gpdhp1與無(wú)明顯差異。單粒種子油份比較發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)單突變體比野生型顯著增加，但是雙突變體無(wú)明顯差異。
　　5、在梯度甘油條件下處理擬南芥幼苗，發(fā)現(xiàn)隨著甘油

7、濃度增加擬南芥根長(zhǎng)生長(zhǎng)逐漸受抑制。1mM甘油濃度以上根長(zhǎng)抑制明顯，且側(cè)根數(shù)目顯著增加。在1mM甘油處理下甘油激酶突變體gli1根系變化不明顯，三磷酸甘油脫氫酶突變體gpdhc1和fad-gpdh的根長(zhǎng)減少程度比野生型更明顯。過(guò)表達(dá)FAD-GPDH家系在甘油處理下根長(zhǎng)不變或略有減少。
　　6、上述根系生長(zhǎng)變化的表型同時(shí)伴隨著體內(nèi)三磷酸甘油含量上升與無(wú)機(jī)磷含量下降。甘油處理下突變體gli1三磷酸甘油與無(wú)機(jī)磷含量沒(méi)有變化。三磷酸含量升高

8、引發(fā)野生型、gpdhc1和fad-gpdh突變體幼苗中的過(guò)氧化氫含量增加。過(guò)表達(dá)FAD-GPDH消除了處理下三磷酸甘油、無(wú)機(jī)磷含量和過(guò)氧化氫含量的變化，導(dǎo)致過(guò)表達(dá)植物對(duì)外源甘油耐受能力增強(qiáng)。這些結(jié)果說(shuō)明甘油造成的根系生長(zhǎng)變化與三磷酸甘油、磷和過(guò)氧化氫含量的改變有關(guān)，也說(shuō)明FAD-GPDH基因在調(diào)控甘油代謝中發(fā)揮著重要作用。
　　7、甘油處理下游離IAA含量增加46％，DR5pro∷GUS在根分生區(qū)的中柱細(xì)胞著色增強(qiáng)，PIN1和PI